نموذج ماوس غير عشوائي لأعاده تنشيط الدوائية من Mecp2 علي كروموسوم X غير نشط
مايو 22, 2019
هنا ، ونحن وصف بروتوكول لتوليد نموذج murine الإناث قابله للحياة مع غير عشوائية X كروموسوم التنشيط ، اي ، أمومي الموروثة X الكروموسوم غير نشط في 100 ٪ من الخلايا. ونحن أيضا وصف بروتوكول لاختبار الجدوى ، والتحمل ، وسلامه أعاده تنشيط الدوائية لكروموسوم X غير نشط في الجسم المجري.
يمكن استخدام هذا البروتوكول لإنشاء نموذج ماوس غير عشوائي لاختبار وتحديد إعادة تنشيط كروموسوم Mecp2 غير النشط المرتبط بـ X في دماغ الماوس الحي. يمكن تعديل هذا النموذج بسهولة لدراسة إعادة تنشيط Xi في نماذج أمراض أخرى مرتبطة بـ X مثل متلازمة DDX3X. أنا آخر وثيقة في مختبر سانشيتا بهاتناغار وسوف يكون إظهار الإجراء مع زيمينغ تشنغ.
تبدأ عن طريق وضع الماوس تخدير في منصة stereotactic مع القواطع مدمن مخدرات في شريط لدغة من المقيد خطم. تشديد المشبك الأنف مع الحفاظ على رأس الماوس على مستوى الطائرة. ضبط ارتفاع قضبان الأذن للوصول إلى الجزء السدومي من قناة الأذن للحفاظ على الرأس غير مُشل.
ثم تطهير الرأس مع مناديل بالتناوب من مطهر الموضعية والإيثانول 70٪. عندما يكون الماوس جاهزًا، استخدم مشرطًا معقمة لإجراء شق أفقي 0.75 سنتيمتر في منتصف فروة الرأس. استخدام 0.45 ملليمتر دبر لحفر اثنين من الثقوب متناظرة فوق نصفي الكرة القشرية اليمنى واليسرى ملليمترين من خياطة القوس وخياطة لامدويد في منتصف تقريبي من العظام الجدارية.
نعلق بحزم حقنة 10 ميكرولتر إلى منصة stereotactic وتحميل 10 ميكرولترات من مثبطات كيميائية أعدت حديثا في الحقنة. تقدم الإبرة في حفرة البور الأولى مع الحفاظ على إبرة عمودي على الجمجمة. عندما تجتاز الإبرة الجمجمة، صفر الإحداثيات على الشاشة الرقمية المجسمة وتقدم طرف الإبرة حتى يصل إلى عمق 2.5 ملليمتر.
سحب إبرة 0.5 ملليمتر إلى عمق مليمترين وحقن ببطء كامل 10 ميكرولتر حجم المحل على مدى فترة دقيقة واحدة. بعد تسليم كل من مثبط، وترك الإبرة في الدماغ لمدة دقيقة أخرى قبل سحب الإبرة. كرر الحقن في ثقب البور الثاني باستخدام السيارة فقط كتحكم وإغلاق الجلد على الشق.
ثم نقل الماوس من جهاز stereotactic على وسادة التدفئة درجة مئوية 37 مع مراقبة حتى الشفاء الكامل. في نهاية نظام الجرعة، وتأمين الماوس على لوحة تشريح. استخدام مقص والملقط لجعل شق الجانبي من خلال integument وجدار البطن فقط تحت القفص الصدري.
فصل الكبد بعناية من الحجاب الحاجز وقطع من خلال الحجاب الحاجز على طول طول القفص الصدري لفضح تجويف الجنبي. استخدم المقص لإجراء شق إلى الطرف الخلفي للبطين الأيسر وحقن على الفور غرفة القلب اليمنى مع حوالي 15 ملليلتر من برنامج تلفزيوني على مدى فترة دقيقتين. وسوف يؤدي الضخ الناجح في تغيير لون الكبد من الأحمر إلى الوردي الشاحب.
عندما تم تسليم كل من برنامج تلفزيوني، ضخ القلب مع ما يقرب من 10 ملليلتر من 4٪ شبهformaldehyde في برنامج تلفزيوني على مدى دقيقتين. بعد حصاد الرأس، استخدم المقص لإجراء شق في منتصف الرأس لفضح الجمجمة. ضع طرفًا واحدًا من المقص في ماغنوم الهضان لتسهيل إنشاء شقّ شقّي في الجمجمة نحو العين.
إجراء شق مماثل على الجانب الآخر من الجمجمة مع الحفاظ على نهاية المقص سطحية قدر الإمكان وقطع منطقة الجمجمة بين العينين وفوق أنف الماوس. استخدم ملقطًا لتقشير عظام الجمجمة من نصفي الدماغ واستخدام ملعقة لرفع الدماغ. تشريح بعناية الألياف العصبية القحفية التي إصلاح الدماغ إلى الجمجمة ووضع الدماغ في طبق من البلاستيك.
ثم اكوس المصابيح المخيخة والشمية. للحصول على أجزاء من أنسجة الدماغ، أولاً إصلاح الدماغ في أنبوب 15 ملليلتر مليئة 4٪ شبهformaldehyde في برنامج تلفزيوني في أربع درجات مئوية بين عشية وضحاها. في صباح اليوم التالي، شطف أنسجة الدماغ ثلاث مرات على الأقل لمدة خمس دقائق في أربع درجات مئوية في برنامج تلفزيوني جديد في الغسيل.
بعد الغسيل الأخير، إزالة الجزء الأمامي من كل نصف الكرة الأرضية مع مقص ملقط ووضع العينات في تسمية قوالب التبريد الجانب الأمامي إلى أسفل. غمر كل نسيج في متوسط درجة حرارة القطع المثلى قبل المفاجئة تجميد العينات في النيتروجين السائل في طبق بيتري البلاستيك 10 ملليمتر للتخزين ناقص 80 درجة مئوية. لتحديد إعادة تنشيط شي، غمر خمسة إلى ستة أقسام أنسجة الدماغ ميكرومتر في محلول استرجاع المستضد لمدة خمس دقائق على كتلة حرارة 100 درجة مئوية.
في نهاية الحضانة، وغسل الشرائح مع أربعة يغسل لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة مع برنامج تلفزيوني الطازجة في غسل قبل غمر الشرائح في حل حجب. بعد 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة، اغسل الشرائح ثلاث مرات لمدة خمس دقائق في مخزن غسيل طازج لكل غسيل. وصمة العينات الأنسجة مع الأجسام المضادة الأولية المناسبة في أربع درجات مئوية بين عشية وضحاها.
صورة الشرائح على المجهر الفلوريسين ضبط التباين والسطوع للسماح quantence من عدد الخلايا الإيجابية GFP لكل من المخدرات والمركبات معالجة نصفي الدماغ الماوس. لإثبات جدوى غير عشوائية X كروموسوم تعطيل نموذج الماوس غير نشط العاشر دراسات إعادة تنشيط كروموسوم، تم تأكيد الأنماط الجينية من الألياف الجنينية الماوس المعدلة وراثيا من قبل genotyping PCR وتدفق الخلايا. كما تم تقييمها من قبل PCR، تم تنشيط التعبير عن GFP الموسومة الميثيلين CPG بروتين ملزم جينين أو MECP2 عن طريق المخدرات ولكن ليس العلاج من السيارة.
غير عشوائية X كروموسوم تعطيل الماوس نموذج الليفية الجنينية أعرب أيضا GFP النووية بعد المخدرات ولكن ليس علاج السيارة مما يدل على مثبطات عامل تعطيل كروموسوم X إعادة تنشيط كروموسوم X المعطلة مرتبطة MECP2 في الليفية الجنينية الماوس. العلاج من المخدرات ينشط المعطل X كروموسوم MECP2-GFP في حوالي 30٪ من الخلايا في نصفي الدماغ المخدرات غرست في حين لم يتم الكشف عن إعادة تنشيط في نصف الكرة الأرضية السيارة غرست. البروتين المرتبطة Microtubule اثنين من الخلايا العصبية الإيجابية هي أيضا GFP إيجابية في نصفي الكرة الأرضية المعالجة المخدرات تشير إلى تعطيل X كروموسوم MECP2-GFP التعبير.
سوف يكون نظام المخدرات تعتمد على الهدف وفعالية مثبطات جزيء صغير حتى تحسين الجرعة والعلاج في المختبر قبل الاختبار في الجسم الحي. ويمكن استخدام نموذج الماوس غير العشوائي لاختبار المخدرات المختلفة إما بشكل فردي أو في تركيبة. في الواقع، ونحن وآخرون قد حددت عدة عوامل تعطيل الكروموسوم X قابلة للأدوية.
اعرض النص الكامل واحصل على الوصول إلى آلاف الفيديوهات العلمية
نظرة عامة
يصف هذا البروتوكول كيفية إنشاء نموذج أنثوي حي من الفئران يتميز بتعطيل غير عشوائي للكروموسوم X، مع استهداف الكروموسوم X غير النشط المرتبط بـ Mecp2 على وجه التحديد. كما يوضح الطرق المستخدمة لتقييم جدوى وسلامة إعادة التنشيط الدوائي للكروموسوم X غير النشط داخل الجسم الحي (in vivo).
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلم
- علم الأعصاب
- علم الوراثة
- علم الأدوية
خلفية علمية
- يُعد تعطيل الكروموسوم X غير العشوائي أمراً بالغ الأهمية لدراسة الاضطرابات المرتبطة بالكروموسوم X.
- يرتبط Mecp2 بمتلازمة ريت، وهي اضطراب نمو عصبي مرتبط بالكروموسوم X.
- قد يوفر إعادة تنشيط الكروموسوم X غير النشط سبلًا علاجية.
- يمكن تكييف هذا النموذج لأمراض أخرى مرتبطة بالكروموسوم X مثل متلازمة DDX3X.
الغرض من الدراسة
- إنشاء نموذج فأر لدراسة تعطيل الكروموسوم X.
- تقييم سلامة إعادة التنشيط الدوائية للكروموسوم X غير النشط.
- تسهيل الأبحاث المتعلقة بالاضطرابات الوراثية المرتبطة بالكروموسوم X.
الطرق المستخدمة
- توليد نموذج أنثوي من الفئران مع تثبيط مستهدف للكروموسوم X.
- استخدام المنصات التجسيمية للاستهداف التشريحي الدقيق.
- تقييم العوامل الدوائية لإعادة التنشيط.
- الاختبار داخل الجسم الحي لمراقبة السلامة والفعالية.
النتائج الرئيسية
- النجاح في توليد نموذج فأر يتميز بتعطيل غير عشوائي للكروموسوم X.
- إثبات جدوى إعادة التنشيط الدوائية.
- وضع بروتوكولات السلامة للتطبيقات داخل الجسم الحي.
- تأكيد إمكانية التطبيق في نماذج أمراض أخرى مرتبطة بالكروموسوم X.
الاستنتاجات
- يوفر هذا النموذج أداة قيمة لدراسة الاضطرابات المرتبطة بالكروموسوم X.
- يظهر إعادة التنشيط الدوائي نتائج واعدة للاستراتيجيات العلاجية.
- هناك حاجة إلى مزيد من الأبحاث لاستكشاف تطبيقات أوسع.
الأسئلة الشائعة
الأهمية الصناعية التنفيذية
تعالج إعادة التنشيط الدوائية لـ Mecp2 من كروموسوم X غير النشط عقبة حرجة في التطوير العلاجي للاضطرابات المرتبطة بالكروموسوم X، مما يتيح الاستقصاء المباشر لاستعادة جرعة الجين في الجسم الحي. يوفر نموذج الفأر هذا، الذي يتميز بتعطيل غير عشوائي للكروموسوم X (XCI)، منصة قوية لتقييم المركبات الدوائية المرشحة التي تستهدف آليات الإسكات فوق الجيني، مما يدعم الثقة التنبؤية في مراحل الاكتشاف المبكر والتحقق من الأهداف. ويسهل هذا النهج اتخاذ قرارات التقدم المعدلة حسب المخاطر لمحفظة الأمراض المرتبطة بالكروموسوم X من خلال قياس فعالية إعادة التنشيط والقدرة على تحملها في نظام ذي صلة بالمرض.
التطبيقات الاستراتيجية في البحث والتطوير في مجال الأدوية الحيوية
الاكتشاف المبكر والتحقق من صحة الهدف
- يمكّن من الاختبار المباشر للفرضيات العلاجية المتعلقة بإعادة تنشيط الجينات المرتبطة بالكروموسوم X في سياق مضبوط داخل الجسم الحي (in vivo).
- يدعم التحقق الوظيفي من مثبطات XCIF وتأثيرها على الإسكات فوق الجيني.
- يوفر قراءات كمية للحد من المخاطر البيولوجية وتوضيح الآليات الجزيئية.
- يسهل عملية فرز الجزيئات المرشحة بناءً على كفاءة إعادة التنشيط داخل الجسم الحي (in vivo).
الفحص وتطوير المقايسة
- تأسيس نظام مُصادق عليه داخل الجسم الحي (in vivo) لفحص مثبطات الجزيئات الصغيرة لـ XCIF.
- تقديم نتائج قابلة للتكرار والقياس الكمي عبر تعداد الخلايا الموجبة لـ GFP في أنسجة الدماغ.
- تمكين توحيد بروتوكولات الجرعات والقراءة لضمان إمكانية المقارنة بين الدراسات المختلفة.
- دعم إمكانية التوسع لاختبار مركبات متعددة أو تركيبات مختلفة بالتوازي.
الأبحاث الانتقالية والما قبل سريرية
- يتوافق مع الأنظمة العصبية ذات الصلة بالمرض لتطوير مؤشرات حيوية انتقالية.
- يوفر استمرارية من مرحلة التحسين في المختبر (in vitro) إلى تقييم الفعالية في الجسم الحي (in vivo).
- يساهم في اتخاذ قرارات المتابعة أو الإيقاف في المرحلة قبل السريرية من خلال قياس مدى ارتباط الهدف في أنسجة الدماغ.
- يقلل من المخاطر الانتقالية عبر نمذجة إعادة التنشيط العلاجية في بيئة ذات صلة فسيولوجياً.
تكامل مسار العمل وسير العمل
يجسر هذا النموذج الفجوة بين الاكتشاف المبكر والتحقق قبل السريري من خلال تمكين الاختبار القائم على الفرضيات لاستراتيجيات إعادة تنشيط الجينات المرتبطة بالكروموسوم X في الجسم الحي.
- بيولوجيا الاكتشاف: تدعم الحد من المخاطر الميكانيكية من خلال قياس إعادة تنشيط الأليلات المسكوت عنها في الأنسجة العصبية.
- الفحص: توفر منصة لتقييم كمي وقابل للتكرار لفعالية مثبط XCIF.
- التحليلات: تقدم مخرجات قابلة للقياس مثل تعداد الخلايا الموجبة لـ GFP لإجراء مقارنة إحصائية لظروف المعالجة.
- الأبحاث الترجمية: تربط النتائج المختبرية بالنتائج الحية، مما يدعم مواءمة المؤشرات الحيوية والتقدم قبل السريري.
- إعادة الاستخدام المؤسسي: قابلة للتكيف لاختبار استراتيجيات إعادة التنشيط عبر نماذج متعددة للأمراض المرتبطة بالكروموسوم X.
التأثير التشغيلي والمؤسسي
- القيمة العلمية: تعزز الثقة التنبؤية في التحقق من الهدف وتقلل من الغموض الميكانيكي للعلاجات الجينية المرتبطة بالكروموسوم X.
- القيمة التشغيلية: توحد مقاييس إعادة التنشيط في الجسم الحي (in vivo) لضمان القابلية للتكرار والتوسع عبر البرامج المختلفة.
- القيمة الاستراتيجية: تتيح اتخاذ قرارات مدروسة بشأن الاستمرار أو التوقف (go/no-go) وتحديد الأولويات للمرشحات الدوائية فوق الجينية بكفاءة رأسمالية.
- تأثير المحفظة: تدعم التقدم المعدل حسب المخاطر وقابلية التطبيق عبر استطبابات متعددة لسلاسل تطوير علاجات الاضطرابات المرتبطة بالكروموسوم X.
اعتبارات التنفيذ
- يتطلب خبرة في الجراحة التجسيمية، والتشريح العصبي، والتصوير الفلوري الكمي.
- يستلزم الوصول إلى أجهزة متخصصة لإجراء حقن دقيقة في الدماغ وتحليل الأنسجة.
- يتطلب بروتوكولات موحدة لتحديد الجرعات، ومعالجة الأنسجة، وقياس البيانات كمياً.
- قابل للتكيف مع أهداف أخرى مرتبطة بالكروموسوم X مع استخدام الهندسة الوراثية والتحقق المناسبين.
- يعد تحسين أنظمة الجرعات واختيار المثبطات أمراً أساسياً للحصول على نتائج قوية في الجسم الحي (in vivo).
