نموذج في المختبر دفعة الثقافة لتقدير آثار النظم التدخلية على ميكروبيوتا البراز البشري

بالنظر إلى الدور الناشئ لميكروبيوم الأمعاء في مختلف الأمراض البشرية ، يمكن للعديد من المكونات المكروبية الأمعاء مثل البروبيوتيك ، والبريبايوتكس ، والوجبات الغذائية والأدوية المساعدة في تخفيف الأمراض الصحية المرتبطة بالميكروبيوم الأمعاء. ومع ذلك لا يوجد نظام فحص سريع وبأسعار معقولة متاحة للتنبؤ بآثار مثل هذه الأمعاء الميكروبيوم التعديلات، ولكن هذا النظام بسيط بما يكفي للتنبؤ كيف يمكن للتدخلات معينة يمكن أن تؤثر على ميكروبيوم الأمعاء التي يمكن أن تؤثر في نهاية المطاف على صحة المضيف. هذا البروتوكول بسيط، وبأسعار معقولة وعملية بالنسبة للمختبرات التحقيق في الأمعاء الميكروبيوم التضمين وآثارها على الميكروبات والصحة المضيفة.

إن الحفاظ على الظروف المُعدّة للتحلل واللاهوائية أمر حاسم لهذه التجربة. أيضا ينبغي أن تستخدم عينة البراز من جديد، على الفور بعد جمع. وإلا إذا كان من المقرر إجراء التجربة لاحقاً، ينبغي تخزين العينة عند ناقص 80 عند جمعها مباشرة، دون التعرض لدرجات الحرارة والهواء المحيطين.

مناولة الدقة أثناء إعداد aliquot و pipetting مهم أيضًا للحفاظ على الدقة وقابلية التكاثر. سيستغرق الأمر أقل من 12 ساعة في النهار. يمكننا بناء ثقافة بين عشية وضحاها إذا كانوا بحاجة إلى العينات في 24 ساعة.

ثم، تليها الأحماض الدهنية قصيرة السلسلة وتحديد الميكروبيوم. وسوف تظهر هذه العملية من قبل اثنين من الطلاب يوني كبيرة، شوكوه الأحمدي ورابينة Mainali من مختبري. لإعداد وسائل الإعلام التخمير تحت غطاء الدخان، في زجاجة كاشفة على خليط المغناطيس، مزيج الحل A، الحل ب، حل المعدنية تتبع، حل فيتامين قابل للذوبان في الماء، حل البيوتين الفولات، حل ريبوفلافين، حل الهمين، مزيج الأحماض الدهنية قصيرة السلسلة، و resazurin.

ثم تضاف إلى زجاجة استخراج الخميرة، كربونات الصوديوم، السيستين هيدروكلوريد أحادية، و trypticase. إضافة 296.1 ملليلتر من الماء المقطر، وضبط درجة الHH مع هيدروكلوريد واحد طبيعي أو هيدروكسيد الصوديوم لضمان أن يكون حوالي 7.0. نقل القارص إلى محطة عمل معقمة، واستخدام فلتر فراغ مع حجم المسام في 0.22 ميكرومتر لتصفية وسائل الإعلام لتعقيم.

لإعداد محلول تخفيف لاهوائي واحد لتر، قم بحل خمسة غرامات من كلوريد الصوديوم، وغرامين من الجلوكوز، و0.3 جرام من هيدروكلوريد السيستين أحادي هيدروهيدرات في الماء المؤين. اُقْف زجاجة الكاشف بغطاء عند درجة حرارة 121.1 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة، ثم قم بتخزينها داخل الغرفة اللاهوائية. قبل بدء تجربة التخمير، احتفظ بجميع المواد والحلول والأدوات اللازمة لتجربة التخمير داخل الغرفة اللاهوائية لمدة 48 ساعة على الأقل، لضمان إزالة أي بقايا أكسجين.

قبل 24 ساعة على الأقل من تجربة التخمير ، تزن 300 ملليغرام من الإنولين ، ونقلها إلى أنبوب 50 ملليلتر ، والذي يتم وضعه بعد ذلك داخل الغرفة اللاهوائية. إضافة 26 ملليلتر من وسائل الإعلام التخمير تعقيم في أنبوب، ودوامة لخلط. السماح ترطيب الألياف لمدة 24 ساعة تقريبا.

يوم تجربة التخمير، وإعداد براز inoculum. أولاً، تزن خمسة غرامات من عينة البراز الطازجة في أنبوب مخروطي 50 ملليلتر. إضافة محلول التخفيف اللاهوائي للأنبوب للوصول إلى حجم نهائي من 50 ملليلتر.

دوامة لمدة 15 دقيقة، أو حتى متجانسة تماما. الحفاظ على الأنابيب تلقيح في 37 درجة مئوية داخل غرفة اللاهوائية، وعكس بلطف مرة واحدة كل ساعة لإعادة توزيع الألياف والإحبن. بعد ثلاث أو ست أو تسع أو 24 ساعة، أخرج الكمية المناسبة من الوسائط المخمرة، والطرد المركزي العينات في 14،000 مرة ز لمدة 10 دقائق في أربع درجات مئوية.

تجميد فورا عظمى وبيليه في النيتروجين السائل، ثم بعد تجميد المفاجئة، وتخزين supernatant لتحليل الأحماض الدهنية قصيرة السلسلة، وبيليه لتحليل الميكروبيوم، في ناقص 80 درجة مئوية. يستخدم هذا البروتوكول لشرح تأثير prebiotic معينة. أظهر براز الأشخاص الأصحاء ، بعد العلاج بالإنولين ، انخفاضًا نسبيًا في مستوى الHH لمدة تسع ساعات ، بينما انخفض بشكل كبير بعد 24 ساعة.

التطعيم من الاينولين زيادة كبيرة في مستويات الأحماض الدهنية قصيرة السلسلة واللاكتات في العينة البراز المعالجة inulin مقارنة مع غير المعالجة زراعة الجراثيم البراز. يُظهر تحليل التنسيق الرئيسي تكوين ميكروبيوتا مختلفًا لمقاييس UniFrac الموزونة وغير المرجحة للتنوع بيتا بين العينات المعالجة وغير المعالجة. مؤشرات من ألفات تنوع مقابل تنوع فيلوجينيك من خلال PD شجرة كاملة, ثراء الأنواع, وحدات التصنيف التشغيلية, يناء الأنواع, فضلا عن وفرة النسبية من phyla الكبرى وأجناس, كل توقيعات ميكروبيوتا الأمعاء مختلفة بين إينولين المعالجة والعينات غير المعالجة.

يمثل كلدوغرام التصنيف، المستمد من تحليل حجم التأثير غير المُتَسَدِد الخطي لمسلسلات 16S، التصنيف الوفرة بالتفاضل بين مجموعات مختلفة من العينات. اتبع جميع الخطوات بعناية. الشيء الأكثر أهمية هو الحفاظ على شروط الصرف الصحي واللاهوائي الصارمة.

يمكن استخدام المابير ومن التجربة لعلاج التغيرات في مستوى الأحماض الدهنية قصيرة السلسلة نتيجة للتخمير القائم على الألياف. بالإضافة إلى ذلك, في بيليه يمكن استخدامها لتحليل التغيرات في تكوين ميكروبيوم الأمعاء. بعض المواد الكيميائية المستخدمة لصنع وسائل الإعلام الثقافة يحتمل أن تكون خطرة.

الرجاء ورقة MSDS واتخاذ الاحتياطات وفقا لذلك.