تصميم الألى ، عاليه الانتاجيه ، والمستمر تجارب نمو الخلايا باستخدام ايفولفير
مايو 19, 2019
يتيح اطار ايفولفير للثقافة الميكروبية المستمرة عاليه الانتاجيه بدقه عاليه وتحكم ديناميكي علي المعلمات التجريبية. يوضح هذا البروتوكول كيفيه تطبيق النظام لاجراء تجربه اللياقة البدنية المعقدة ، وتوجيه المستخدمين علي برمجه التحكم الألى علي العديد من الثقافات الفردية ، وقياس ، وجمع ، والتفاعل مع البيانات التجريبية في الوقت الحقيقي.
eVOLVER يعطي الباحثين الحرية التجريبية، والقدرة على تحديد تجاربهم نمو الثقافة الخاصة بهم مع ردود الفعل الآلي على معلمات متعددة وتوسيع نطاقها إلى أي حجم يحتاجون إليه. eVOLVER أكثر مرونة من الأجهزة الأخرى. يمكن للمستخدمين بسهولة تخصيص البرمجيات في بيثون وكذلك الأجهزة ، عن طريق تعديل الأكمام الذكية التي تحمل أجهزة الاستشعار لكل ثقافة.
يمكن أن يبدو النظام معقدًا للوهلة الأولى مع العديد من المكونات والاتصالات. يعطي الدليل المرئي للمستخدمين لأول مرة المزيد من الثقة في إجراء التجارب بمفردهم. الإعداد المناسب أمر بالغ الأهمية.
تأكد من فهم ما يفعله كل مكون. حتى تتمكن من تأكيد أنها تعمل. تأكد من توجيه كل شيء بشكل صحيح وتوصيله بإحكام.
في حين أن مصممة لمعالجة البكتيريا والخميرة الهوائية في ظروف مختلفة، يمكن أيضا أن يتم تعديل eVOLVER للتخمير اللاهوائي أو للحفاظ على خلايا الثدييات في التعليق. هذا الفيديو سوف يوضح كيفية إعداد و تهيئة وتشغيل تجربة ثقافة مستمرة عالية الإنتاجية باستخدام النظام الأساسي eVOLVER. في اليوم السابق للتجربة، إعداد وسائل الإعلام، وقنينات، وتلقين وفقا للمخطوطة.
في ثلاثة قاروب كبيرة، وإعداد اثنين من القارض 10٪، وقار واحد من 70٪ الإيثانول. باستخدام مفاتيح على جهاز eVOLVER، تشغيل إمدادات الطاقة فولت خمسة على eVOLVER، والانتظار لمدة خمس ثوان، ثم بدوره على امدادات الطاقة 12 فولت. إذا كان يتم تشغيل قوارير متعددة من زجاجة الوسائط نفسها، قم بتوصيل خطوط إدخال وسائط متعددة مع تقسيمات الأنابيب.
يمكن إنشاء مقسمات أنابيب مخصصة مع مكونات أقل. غمر خطوط مدخلات وسائل الإعلام في أول منبر التبييض وخطوط eflux وسائل الإعلام في التبييض الثاني. قم بتوصيل نهاية اتجاه مجرى النهر لخطوط إدخال الوسائط بقارق الثاني مع خطوط eflux.
ضع خطوط النفايات في كاربوي النفايات. إضافة لتر واحد إلى اثنين من التبييض في carboy النفايات لتعقيم النفايات المتولدة خلال التجربة. باستخدام شاشة اللمس على eVOLVER، انتقل إلى قسم الإعداد وتشغيل جميع المضخات لمدة 20 ثانية لملء خطوط السوائل مع 10٪ التبييض.
السماح للتبييض للجلوس في الخطوط لمدة 30 دقيقة على الأقل لتعقيم. تشغيل المضخات مرة أخرى باستخدام شاشة اللمس حتى لم تعد مغمورة الخطوط، ودفع الهواء من خلال خطوط للحصول على أكبر قدر ممكن من التبييض. ضع خطوط إدخال الوسائط في منبر الإيثانول، واملأ الخطوط بالإيثانول، واغسلها بالهواء.
ثم، إرفاق وسائل الاعلام خطوط المدخلات إلى زجاجات وسائل الإعلام مع وصلات أقل وتشغيل المضخات حتى وسائل الاعلام يعمل بشكل كامل من خلال خطوط طرد أي الإيثانول المتبقية. جزئيا إدراج قوارير معقمة في الأكمام الذكية eVOLVER وربط خطوط المدخلات إلى قش التدفق القصير وخطوط النفايات إلى القش طويل eflux وفقا لترميز اللون. اضبط على شاشة اللمس eVOLVER لتشغيل جميع المضخات بزيادات 10 ثانية لملء القنينات بالوسائط.
تأكد من خلال الفحص البصري، تقوم مضخات eflux بإزالة الوسائط بكفاءة من خلال قش الإللوكس لمنع الفيض. ثم، ادفع قنينات لأسفل حتى تكون مغطاة بالكامل بالأكمام الذكية. على صفحة الإعداد التفاعلية لشاشة اللمس eVOLVER، اسحب إصبعًا عبر شاشة اللمس أو اضغط على الزر تحديد الكل لتحديد جميع القنينات وتعيين الظروف الأولية لدرجة الحرارة عند 30 درجة مئوية والتحريك إلى 10.
على جهاز كمبيوتر، حدد جهاز eVOLVER الذي سيتم تشغيل التجربة عليه. تأكد من تحديد إعدادات المعايرة المطلوبة. افتح لوحة معلومات eVOLVER وانتقل إلى صفحة إدارة التجارب.
حدد التجربة الأساسية في لوحة "مستكشف التجربة" أو تجربة موجودة كنقطة بداية وانقر فوق Clone . انتقل إلى صفحة محرر التجربة. استخدم لوحة فيال Selector و Parameter Definition لضبط درجة الحرارة إلى 30 درجة مئوية وتعيين عتبة أعلى وأسفل من OD لكل قارورة وفقًا للتصميم التجريبي.
حفظ التجربة بالنقر فوق حفظ. ثم انقر فوق السهم للعودة إلى صفحة إدارة التجارب ثم انقر فوق الزر تشغيل لتشغيل. بمجرد أن تكون التجربة قيد التنفيذ، انتقل إلى لوحة بيانات الوقت الفعلي في لوحة المعلومات التفاعلية.
لكل قارورة، تحقق من أن قيم OD يتم الاحتفاظ عند الصفر. تصفح من خلال الرسوم البيانية درجة الحرارة للتأكد من أن درجات الحرارة في أو تتقدم نحو 30 درجة مئوية. لإعداد inoculum، أولا قياس OD من الثقافات بين عشية وضحاها وحساب التخفيف الكامل المطلوب للثقافات بين عشية وضحاها على افتراض حجم قارورة 25 ملليلتر و OD البداية المطلوبة من حوالي 0.05.
من خلال ميناء أخذ العينات، ماصة الحجم المحسوب من inoculum أو خليط من inocula. تحقق من الرسوم البيانية على لوحة القيادة لمعرفة أن زيادة OD إلى 0.05. ويمكن رصد نمو الخلايا وظروف القارورة في الوقت الحقيقي مع استمرار التجربة، مما يسمح للباحث بالتدخل في حالة حدوث أي مشاكل.
eVOLVER هو منصة ثقافة مستمرة آلية تسمح بالسيطرة على ظروف الثقافة. وقد تم عرض الفروق النوعية بين الأنواع البرية، ودرجة الحرارة الحساسة، والمجموعات الحساسة للملح عندما تم رسم نسب السجل ضد الأجيال المستنِدة من بيانات معدل نمو eVOLVER. يشير اللون إلى درجة حرارة الاختيار، بينما تميز الشرطات تركيزات الملح.
المنحدر يصلح من خلال الجزء الخطي من كل قطعة باستخدام الحد الأدنى من ثلاث نقاط، تسفر عن قيمة اللياقة البدنية الكمية التي تصف كيف تتنافس سلالة البديل ضد سلالة مرجعية. تشير قيم اللياقة البدنية السلبية إلى أن السلالة البديلة هي خارج تتنافس من قبل سلالة مرجعية. تحقق دائما من أن جميع المضخات تعمل بكفاءة وأن خطوط السوائل واضحة من أي القباقيب.
يمكن أن يؤدي تجاوز السعة إلى تدمير تجربة ما ومن المحتمل أن يؤدي إلى تلف الأكمام الذكية. ويمكن فيما بعد تحديد عينات مأخوذة من "إيفولتفر" للتحقق من التغيرات الجينية نتيجة للتجربة. ويمكن استخدام هذه المعلومات لهندسة سلالات أو أنظمة جديدة.
بالنسبة للباحثين الذين يستخدمون التطور المختبري أو اختيار المكتبة، من السهل تطبيق ضغوط اختيار فريدة في كل تجربة eVOLVER. السيطرة على ردود الفعل والبيئات الديناميكية الآن يمكن الوصول إليها جدا أيضا. سوف carboy النفايات تحتوي على كميات صغيرة من التبييض والإيثانول بعد تجربة.
استشر منسق السلامة في المختبر للتخلص من النفايات بشكل صحيح.
نظرة عامة
يسمح إطار عمل eVOLVER بزراعة الكائنات الحية الدقيقة المستمرة عالية الإنتاجية مع التحكم الديناميكي في المعاملات التجريبية. يوجه هذا البروتوكول المستخدمين في برمجة التحكم الآلي في زراعة متعددة أثناء القياس والتفاعل مع البيانات في الوقت الفعلي.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلم
- زراعة الكائنات الحية الدقيقة
- أنظمة التغذية الراجعة الآلية
- التصميم التجريبي
الخلفية
- يوفر نظام eVOLVER المرونة في تصميم تجارب نمو المزارع.
- يسمح بتخصيص كل من مكونات البرامج والأجهزة.
- الإعداد الصحيح وفهم المكونات أمر بالغ الأهمية لنجاح التجارب.
- يمكن تكييفها لظروف زراعة مختلفة، بما في ذلك التخمير اللاهوائي.
غرض الدراسة
- لتوضيح إعداد وتشغيل منصة eVOLVER لتجارب الثقافة المستمرة.
- لتمكين المراقبة والتحكم في الوقت الفعلي في زراعة الكائنات الحية الدقيقة.
- لتسهيل دراسة الاختلافات في اللياقة بين سلالات الكائنات الحية الدقيقة المختلفة.
الطرق المستخدمة
- تحضير الوسط وتعقيم المعدات.
- إعداد نظام eVOLVER وبدء التجارب.
- مراقبة البيانات في الوقت الفعلي من خلال لوحة معلومات تفاعلية.
- تحليل معدلات النمو وقيم اللياقة للسلالات الميكروبية.
النتائج الرئيسية
- نجاح التشغيل الآلي لتجارب الثقافة المستمرة.
- المراقبة في الوقت الفعلي للكثافة الضوئية (OD) ودرجة الحرارة.
- قيم اللياقة الكمية المشتقة من بيانات معدل النمو.
- تحديد اختلافات الأداء بين المتغيرات الميكروبية.
الاستنتاجات
- نظام eVOLVER يعزز التحكم التجريبي والمرونة.
- تسمح البيانات في الوقت الفعلي بالتدخل الفوري في التجارب.
- يدعم هندسة السلالات الجديدة بناءً على النتائج التجريبية.
الأسئلة الشائعة
Executive Industry Relevance
The eVOLVER platform enables high-throughput, automated continuous culture with real-time monitoring of optical density and temperature, supporting scalable fitness landscape mapping for strain engineering and selection studies. Its open-source software and modular hardware allow rapid reconfiguration for multiparameter experimental designs, reducing manual intervention and increasing reproducibility in microbial strain characterization. This positions eVOLVER as a reusable discovery tool for de-risking target validation and lead identification in antimicrobial, metabolic, and synthetic biology programs.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables quantitative fitness profiling of mutant libraries under defined selection pressures to interrogate gene function and pathway essentiality.
- Operational Value: Automates continuous culture with feedback control, reducing manual sampling and enabling long-term, unattended experiments.
- Scientific Value: Supports mechanistic de-risking by linking genotype to fitness under controlled environmental conditions.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative growth rate and fitness metrics from real-time OD and temperature data for comparative strain analysis.
- Operational Value: Standardizes culture conditions across hundreds of parallel vessels via programmable fluidic and sensor arrays.
- Scientific Value: Facilitates assay readiness by providing reproducible, dynamically controlled environments for library selection and evolution experiments.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Enables longitudinal tracking of genomic adaptations in evolving populations, informing strain engineering for therapeutic production.
- Operational Value: Supports scalable preparation of evolved strains for downstream phenotypic validation in disease-relevant models.
- Scientific Value: Enhances predictive confidence in strain performance by measuring competitive fitness across environmental gradients.
Pipeline & Workflow Integration
eVOLVER integrates into early discovery workflows by enabling hypothesis-driven fitness screening, assay development for evolution-based selection, and translational strain optimization prior to preclinical validation.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing through precise environmental control and quantitative fitness readouts across genetic variants.
- Screening: Enables high-throughput, reproducible growth selection assays with real-time monitoring and automated feedback.
- Analytics: Provides real-time OD, temperature, and derived fitness metrics for longitudinal comparison of culture conditions.
- Translational Research: Connects discovery-phase evolution to preclinical strain engineering by identifying adaptive mutations under selection.
- Enterprise Reuse: Functions as a reconfigurable platform for multiple campaigns, reducing need for bespoke culture systems per project.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive fitness modeling, target validation via competitive growth, reduction of phenotypic ambiguity.
- Operational Value: Standardization, automation, and scalability of continuous culture across environmental gradients.
- Strategic Value: Improved go/no-go decisions in strain selection, reduced biological risk in development candidates.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization of engineered strains based on quantitative fitness landscapes.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microbial culture, microfluidics, and Python-based software customization.
- Needs perfusion pumps, temperature control units, smart sleeves, and real-time data monitoring infrastructure.
- Demands cross-team standardization of protocols for media preparation, sterilization, and sampling.
- Requires adaptation of fluidic layouts and sensor configurations for different organism types and selection pressures.
- Limited by clogging risks in fluid lines and the need for regular maintenance to prevent experimental failure.
