الكشف عن ورصد الورم المرتبطة تعميم الحمض النووي في Biofluids المريض

هذا البروتوكول يتيح الكشف عن الطفرات المرتبطة بالورم ويكمل حاليا العمليات الجراحية الغازية. قوة أخرى هي القدرة على استخدام هذا البروتوكول لرصد الحمل الطفرة الورم العمل الإضافي. هذه التقنية تمكن الورم genotyping دون الحاجة إلى خزعة الأنسجة الجراحية الفعلية التي هي مفيدة بشكل خاص للأورام في مواقع صعبة، مثل جذع الدماغ مع وصول مقيد للأنسجة.

في غياب تكرار الخزعة، لا تتوفر البيانات الجزيئية الطولية لتكمل التصوير بالرنين المغناطيسي. تسهل مراقبة PCR الرقمية ملحقًا جزيئيًا للتشخيص ، مما يتيح عملية صنع قرارات علاجية أكثر استنارة. ويمكن استخدام أساليب مماثلة للكشف عن التعبير عن الجينات في نظام معين، مع تحقيقات Fluo-4 التقليدية والمرتبطة quencher ولكن مع حساسية أعلى من مع PCR الكمية.

قبل البدء في إجراء PCR الرقمية القطيرة، وتنظيف مساحة مقاعد البدلاء والمعدات مع 10٪ التبييض و 70٪ الإيثانول ودوامة بلطف والطرد المركزي لفترة وجيزة جميع الكواشف، باستثناء قطرة استقرار النفط. تأكد من أن اسطوانة غاز النيتروجين المضغوطة متصلة بآلة توليد القطرات وأن خزان الأسطوانة يتم ضبطه بـ 90 رطلًا لكل بوصة مربعة. و38 ميكرولترات من خليط التفاعل PCR الرقمية مباشرة في الجزء السفلي من كل بئر من ثمانية بئر أنبوب PCR قطاع، وإزالة أي فقاعات مع طرف ماصة نظيفة.

إضافة 12 ميكرولترات من عينة الحمض النووي تضخيمها مسبقا في ثلاثية إلى الآبار المناسبة من قطاع أنبوب. بلطف الماصة كامل حجم 10 مرات لخلط خليط التفاعل مع عينة الحمض النووي والماصات حجم كامل من كل بئر في القنوات A من خلال H المقابلة من رقاقة أداة توليد قطرة. إدراج شريط أنبوب PCR جديدة في أداة توليد قطرات ومسح قطرة توليد معرف رقاقة الصك في البرنامج على جهاز الكمبيوتر الصك.

ثم انقر فوق بدء تشغيل لبدء عينات قطرة. عند اكتمال عملية القطرة، قم بإزالة شريط أنبوب PCR وتطبيق قبعات شريطية أنبوبية. نقل شريط أنبوب لدورة حرارية وتحقيق التوازن بين أنبوب مع شريط أنبوب آخر يحتوي على 80 ميكرولترات من الماء في البئر.

ثم تشغيل دورة الحرارية في ظل ظروف مناسبة ركوب الدراجات الحرارية. استبدل أغطية الشريط بأحرف عالية السرعة. عندما يكتمل الدراجات الحرارية، قم بنقل شريط الأنبوب إلى أداة القياس الكمي، انقر فوق إعداد تشغيل على برنامج الأدوات ووضع شريط الأنبوب في أداة القياس الكمي.

ضع الدرع المعدني على رأس رقاقة أداة الكم الجديدة، وامسح معرف الشريحة في الأداة وأدخل الشريحة في الجهاز. أغلق غطاء الأداة. في برنامج الكمبيوتر، أدخل اسمًا لتشغيل PCR الرقمي ولكل قناة من القنوات الثمانية، ثم حدد الوضع السريع وانقر فوق ابدأ لبدء القياس الكمي.

لتحليل البيانات الطيفية الخام، قم بتشغيل برنامج المحلل وفتح ملفات fcs. ضمن طريقة عرض التحليل، حدد سليمة. ضمن طريقة عرض العينة، انقر فوق المربعات بجانب كل من العينات الثمانية.

البرنامج سوف رسم إشارات ل alleles نوع متحولة والبرية على طول محور س و ص على التوالي. استخدم وظيفة المصفوفة المحسوبة لتطبيق التعويض الطيفي على القطرات السليمة، حسب مدربي المصنعين وضبط إعدادات المحور ضمن خيارات المحور. تعيين المحور س إلى الحد أدنى من صفر والحد الأقصى 30,000 و المحور ص إلى حد أدنى من ناقص 5,000 و الحد أقصى 10,000.

عندما يتم تحديد مجموعات القطرات، اضبط المحور لتقليل المساحة الفارغة في الرسم البياني. حدد العينة المقابلة للحمض النووي الجينومي للأنسجة الورمية المكافحة الإيجابية لتعيين بوابات النوع المتحول والبري السلبي ، مما يضمن أن المجموعات متميزة ويسهل تحديدها. ثم انقر بزر الماوس الأيمن وحدد تطبيق كافة الإعدادات على عينات مختارة لتطبيق إعدادات البوابة للتحكم الإيجابي على جميع العينات.

ضمن طريقة العرض الرسومية، انقر فوق نماذج متعددة لعرض الرسومات لكافة العينات المحددة ثم تصدير الصورة كملف tif. ثم ضمن مساحة العمل، حدد تحليل التصدير واحفظ ملف البيانات الذي تم تحليله كملف csv. هنا، تظهر نتائج تمثيلية للكشف الناجح عن طفرة في البلازما قبل تضخيمها وخلايا السائل النخاعي خالية من الحمض النووي من طفلين مع الأورام الدبقية خط الوسط المنتشر.

في هذه التجربة، يمكن ملاحظة فصل واضح بين مجموعات الأنواع المتحولة والبرية على طول محور س و ص على التوالي. تشير مجموعات الأنواع البرية القوية إلى أن استخراج الحمض النووي الحر للخلية كان ناجحًا لأن الحمض النووي للقالب موجود. بالنسبة لهؤلاء المرضى، تظهر المجموعات المتحولة ترددًا ثلاثيًا للطفرات بنسبة 1.6 و39.32 في المائة لعينات السائل النخاعي والبلازما على التوالي وفقًا لحالة طفرة الورم كما أكدها التحليل الجينومي لأنسجة الورم الخزعة.

أما السيطرة السلبية من ناحية أخرى فتظهر صفر قطرات من النوع البري المتحول صفر تشير إلى أنه لم يكن هناك تلوث لخليط تفاعل PCR. يبين الحمض النووي الجينومي للأنسجة الورمية التي تتحكم في الورم الطفرة التي يتم اكتشافها في التردد الـ allelic المتوقع لعينة الورم المحددة. قد لا يعني عدم وجود كشف الطفرات داخل البلازما أن المريض من النوع البري لطفرة الفائدة كما تحدث السلبيات الكاذبة.

على سبيل المثال ، في هذا المريض ، على الرغم من عدم اكتشاف طفرة الاهتمام ، تم تأكيد حالة الطفرة عن طريق التحليل الجينومي للأنسجة الورمية. 10- إنّ نظام PCR هو تقنية حساسة للغاية تتطلب إزالة التلوث المتكرر من منطقة العمل والمعدات لتجنب الحصول على بيانات إيجابية خاطئة.