طريقة لدراسة تشكيل دي نوفو من مجالات الكروماتين

نحن نحدد نظام لتقييم التكوين الديناميكي للنطاقات الكروماتين. نحن نستخدم هذا النظام لمتابعة تجنيد ونشر المجالات الكروماتين بوساطة PRC2 في الخلايا. يمكن إيقاف العملية مؤقتاً في أي وقت لتحليل الأحداث قيد التقدم.

ويمكن توجيه هذا النظام لرصد التغيرات الديناميكية في أي عملية خلوية معينة، وبالتالي لا يقتصر على تتبع تشكيل نطاق الكروماتين. ابدأ بتصميم دليل RNAs لحذف Exon 10 و 11 من نسخة داخلية من تطوير الخلايا الجنينية الجنينية، أو EED، في الخلايا الجذعية الجنينية الفينية باستخدام أداة تصميم CRISPR. استنساخ RNAs دليل في CRISPR / Cas9 plasmid وفقا لاتجاهات المخطوطات.

في شكل لوحة ستة جيدا، transfect 200، 000 الخلايا الجذعية الجنينية الماوس، أو mESCS، مع ميكروغرام واحد من كل رنا دليل باستخدام الكواشف transfection وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. تغيير الوسائط بعد 24 ساعة من عملية النقل. بعد يومين من عملية التشويق، قم بعزل الخلايا الإيجابية GFP باستخدام FACS.

كفاءة Transfection تتراوح بين حوالي 10 إلى 30٪ حتى فرز حوالي 500، 000 الخلايا لالتقاط الخلايا الإيجابية GFP كافية للطلاء. لوحة الخلايا الإيجابية GFP المعزولة في لوحات 15 سم التي هي قبل المغلفة مع 0.1٪ الجيلاتين لقطف مستعمرة. قم بزراعة الخلايا في الوسط ESC لمدة أسبوع واحد تقريباً حتى تكون المستعمرات مفردة مرئية، مع التأكد من تغيير الوسائط كل يومين.

اختيار ما لا يقل عن 48 مستعمرات باستخدام طرف ماصة 20 ميكرولتر لكشط فوق المستعمرة في حين التعرق. دون تقسيم المستعمرة إلى خلايا واحدة، نقله إلى لوحة Accutase التي تحتوي على 96 جيدا. احتضان المستعمرات في 37 درجة مئوية لمدة 10 دقائق لتفكك الخلايا.

ثم إضافة 200 ميكروليترس من وسائل الإعلام ESC إلى كل بئر مع ماصة متعددة القنوات. تخلط جيدا وطبق الخلايا في اثنين من لوحات منفصلة 96-جيدا. استخدام واحدة من لوحات لgenotyping، والحفاظ على غيرها من النمو حتى يتم إبرام جينوتيبينغ.

استخراج الحمض النووي من لوحة باستخدام الكواشف التجارية واتباع توجيهات الشركة المصنعة. استخدام ال التمهيدي genotyping التي تمتد على الموقع المحذوفة لأداء جينوتيبينغ PCR مع طق DNA البوليميراز. مراقبة منتج الحمض النووي من الوزن الجزيئي أقل في الخلايا مع حذف homozygous نسبة إلى خلايا من نوع البرية.

دليل التصميم RNA لإدخال قطع داخل intron بعد exon 9 من EED باستخدام أداة تصميم CRISPR ، واستنساخها في CRISPR / Cas9 plasmid وفقًا لاتجاهات المخطوطات. تصميم الحمض النووي قالب المانحة التي تشمل تسلسل eED cDNA بعد exon 9 وعلامة C-محطة العلم HA المنبع من تسلسل T2A-GFP، وكلها في الاتجاه العكسي فيما يتعلق تسلسل الجينات الذاتية. الجناح الكاسيت مع لصق-acceptor وتسلسل تعددي المعادن متداخلة بين مواقع اللوإكسب المقلوبة، وتشمل ما لا يقل عن 500 أزواج قاعدة من الأسلحة homology من كل نهاية.

تقسيم قالب المانحة إلى قسمين من gBlocks شظايا الجينات، وتجميعها في ناقل PCR بلانت باستخدام استنساخ جيبسون اتباع تعليمات الشركة المصنعة. في شكل لوحة من ستة آبار، transfect 200، 000 mESCs مع ميكروغرام واحد من RNA دليل وم ميكروغرام واحد من القوالب المانحة. ثم قم بعزل الخلايا الإيجابية GFP باستخدام FACS.

عزل المستعمرات الفردية لgenotyping وفقا لاتجاهات المخطوطات. استخدم قياس تدفق الخلايا للتأكد من أن mESCs ليس لديها تعبير متسرب من GFP، وإذا فعلوا ذلك، قم بعزل الخلايا السلبية GFP بواسطة FACS قبل بدء التجربة. توسيع الخلايا إلى خمس لوحات 15 سم، والحث على التعبير عن البرية من نوع أو قفص متحولة EED من خلال إدارة 5 ميكرومولار 4-هيدروكسيتاموكسيفين لمدة خمس فترات زمنية مختلفة تتراوح بين صفر ساعة وثمانية أيام.

تغيير وسائل الإعلام بعد 12 ساعة للعلاجات التي تستمر لفترة أطول من ذلك. عزل الخلايا المؤتلفة بنجاح بواسطة FACS باستخدام GFP، وتنفيذ ChIP-seq لH3K27me2 وH3K27me3 للتحقيق في ترسبها الزمني إلى الكروماتين استجابة لإعادة التعبير عن EED من النوع البري أو القفص المتحول. للتحقق من صحة الإنقاذ البرية من النوع غير القابلة للتسامي وأنظمة الإنقاذ المتحولة غير القابلة للتكريس ، تم تنفيذ البقعة الغربية على مقتطفات كاملة بعد تحريض EED من النوع البري أو القفص المتحول مع علاج 4-hydroxytamoxifen.

تم استخدام تحليل تدفق قياس الخلايا لتأكيد كفاءة التعبير T2A-GFP في خلايا i-WT-r قبل وبعد معالجة 4-hydroxytamoxifen، مما يدل على نجاح الوجه من الكاسيت المقلوب. تم تنفيذ ChIP-seq من H3K27me3 بعد إعادة التعبير عن نوع البرية أو قفص متحولة EED. ويلاحظ ظهور H3K27me3 في 12 ساعة بعد التعبير EED من النوع البري في مواقع نووية منفصلة ثم في 24 ساعة في المناطق البعيدة عن مواقع النوى الأولية.

كما استُخدم النظام المُسبق لـ ChIP-seq لتتبع الترسيب الزمني لـ H3K27me2، الذي يبدو أنه يسبق ترسب H3K27me3. كما تم تصور بؤر H3K27me3 ونموها مع المجهر الفلوري. بعد 12 ساعة من التعبير EED من النوع البري ، هناك أدلة على تشكيل بؤر H3K27me3.

هذه بؤر زيادة في العدد والحجم من قبل 24 ساعة وانتشرت في نهاية المطاف إلى مناطق كبيرة من النواة من قبل 36 ساعة. تصميم دقيق من بنيات الحمض النووي مهم جدا لتوليد نظام الإنقاذ غير المرغوب فيه. يمكن أن توفر هذه الطريقة تحكمًا زمنيًا وخاصة في طفرات البروتينات في الفئران.

وبهذه الطريقة، يمكن للمرء أن يحدد تأثير الطفرات في نسيج معين أو في مرحلة محددة من التطور. نحن حاليا باستخدام هذا النظام لرصد إنشاء دينامية أخرى chromatin المجال ، Polycomb القمعية المعقدة 1.