Name: القياس الكمي لانزيم A في الخلايا والانسجه (فيديو) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-09-27T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 51 s
Description: تعلم قياس إنزيم أ في الخلايا والأنسجة باستخدام كروماتوغرافيا السائل عالي الضغط. هذه الطريقة الموثوقة تساعد الباحثين على دراسة التمثيل الغذائي والتنكس العصبي.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

ويقر المؤلفون بتمويل البحوث التي ترعاها شركه CoA Therapeutics, Inc. ، وهي شركه تابعه لبريدجبيو LLC ، والمعاهد الوطنية للمنح الصحية GM34496 ، والجمعيات الخيرية السورية اللبنانية المرتبطة.

أجريت الإجراءات الحيوانية المشار اليها في هذا البروتوكول وفقا للبروتوكولات 323 و 556 والتي وافقت علي وجه التحديد من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية الحيوانية واستخدامها في مستشفي سانت جود للأطفال.
1-اعداد الحلول
ملاحظه: استخدام المياه نقاء لجميع الحلول وعندما ذكر في الإجراءات.
<ol><li>اعداد 1 ملم هيدروكسيد البوتاسيوم (كوة) في الماء.</li>
	<li>اعداد 0.25 M كوة في الماء.</li>
	<li>اعداد 1 م Trizma-HCl في الماء وضبط لدرجه الحموضة 8.0.</li>
	<li>اعداد 100 mM monobromobimane (mBBr) في اسيتلونيتريل (اوبتيما الصف). حلول الأسهم من mBBr مستقره في-20 درجه مئوية لعده أشهر شريطه ان يتم الاحتفاظ بها في الظلام كما يمكن التعرض للضوء photöobimane إلى bimane26.</li>
	<li>اعداد المخزن المؤقت لغسل المرحلة الصلبة (مهندس) العمود: 50 ٪ الميثانول (اوبتيما الصف) + 2 ٪ حمض الخليك.</li>
	<li>اعداد العازلة لعمود مهندس البترول المصري: 95 ٪ الايثانول (HPLC الصف) التي تحتوي علي 50 mM formate الأمونيوم.</li>
</ol>2. اعداد معيار CoA-bimane
<ol><li>شراء معيار CoA عاليه الجودة من مصدر السمعة (علي سبيل المثال ، Avanti القطبية الدهون ، وشركه).</li>
	<li>اعداد حل الأسهم عاليه التركيز من CoA في تريس 20 مم ، pH 8. يتم تحديد كميه CoA في المخزون عاليه التركيز أو تاكيدها من قبل الامتصاص الطيفي في λ 260 nm (Ɛˈli = 16,800 M-1-سم-1). أضافه 4 اضعاف المولي الزائدة من mBBr; دوامه علي ارتفاع لمده 10 ليالي. علي سبيل المثال ، للحصول علي 10 مم CoA في المخزن المؤقت ، أضافه 40 mM mBBr. يتم أضافه mBBr الزائدة للتاكد من ان جميع CoA هو ديريفاتيزيد.</li>
	<li>احتضان في درجه حرارة الغرفة ل 4 ح في الظلام دون اهتزاز لديريفاتيزي CoA مع mBBr. يتفاعل mbbr مع مجموعه ثيول من CoA ، وهو الأس الهيدروجيني ودرجه الحرارة تعتمد27. بالاضافه إلى تحويل mBBr CoA إلى فلوري للذوبان في الماء (أو الاشعه فوق البنفسجية الماصة) CoA-bimane (CoA-bimane; الشكل 2).</li>
	<li>أضافه 100 μL حمض الخليك ودوامه علي ارتفاع ل 10 ثانيه لوقف رد الفعل.</li>
	<li>الطرد المركزي في 2,000 x g لمده 15 دقيقه لأزاله اي اندفاع.</li>
	<li>تنظيف ماده طافي باستخدام عمود مهندسي البترول لأزاله mbbr غير المتفاعلة (الموصوفة أدناه). الترشيح والطرد من المراوغة ليست ضرورية بعد تنظيف عمود مهندس البترول الخاص (القسم 5.8).</li>
	<li>جمع الشطف من العمود الذي يحتوي علي coa-bimane في أنبوب قبل وزنه ، والجافة تحت غاز النيتروجين ، وتزن وبناء منحني المعايرة القياسية مع كميات معروفه من CoA-bimane.<ol>
<li>تحقق من معيار CoA-bimane للنقاء من قبل HPLC (انظر أدناه) مع الكشف عن الامتصاص في كل من λ 260 (adenine moiety) و λ 393 (bimane moiety) وصدفه من كلا القمم في الكروماتوجرام.</li>
		<li>تاكيد كميه من معيار CoA-bimane في المخزون عاليه التركيز باستخدام λ 260 nm (Ɛˈli = 16,800 M-1-سم-1).</li>
	</ol>
</li>
	<li>تسجيل الاحتفاظ HPLC الوقت للتعرف علي CoA-bimane في عينات تجريبية باستخدام معيار CoA-bimane.</li>
	<li>تخزين الارصفه من المخزون عاليه التركيز من معيار CoA-bimane محمية من الضوء وتخزينها في-20 درجه مئوية لمده تصل إلى 2 سنوات. تجنب الذوبان المتكرر وأعاده التجميد.</li>
</ol>3. استخراج واشتقاق من CoA في الخلايا المستزرعة
<ol><li>حصاد الخلايا الملتصقة في الثقافة عند الاقتراب من الكثافات سوبكونفلوينت المتاخره. علي سبيل المثال ، نمت الخلايا HepG2/C3A البشرية إلى كثافة 6-8 x 106، أو الخلايا يشيك 293t نمت إلى كثافة من ~ 1.3 x 107 لكل 100 مم طبق.<ol>
<li>استخدم الثقافات المكررة أو ثلاثية النسخ بشكل روتيني لتحديدات CoA. احتضان الاطباق الثقافية منفصلة بالتوازي مع الثقافات خليه عينه لتحديد رقم الخلية قابله للحياة. حساب كميه CoA لكل 106-107 خلايا بعد تنقيه hplc.</li>
	</ol>
</li>
	<li>الاسبرين الثقافة المتوسطة قباله الطبق. بسرعة غسل الخلايا علي الطبق مع الجليد الباردة الفوسفات-مخزنه المالحة (تلفزيوني) لأزاله اي المتوسطة المتبقية ويستنشق التلفزيونية قباله الطبق. بسرعة غسل الخلايا مع الماء البارد الجليد لأزاله المتبقية تلفزيوني ويستنشق الماء قباله الطبق بسرعة. تجنب إزعاج الخلايا الملتصقة عند أضافه تلفزيوني أو الماء.</li>
	<li>أضف 1 مل من الماء المثلج إلى طبق الثقافة. كشط الخلايا في الماء البارد في الطبق ونقل تعليق الخلية إلى أنبوب اختبار الزجاج التي تحتوي علي 400 μL من 0.25 M كوة و 1.5 mL من الماء.<ol>
<li>تخلط التعليق بقوة بواسطة الدوامة علي ارتفاع لمده 10 ليالي. ثم تغطي باحكام مع الفيلم البارافين واحتضان في 55 درجه مئوية ل 1 ح دون اهتزاز في حمام مائي. يجب ان يكون pH العينة ≥ 12. درجه الحموضة العالية من المهم ان التحلل ثيوترات CoA ويمكن تعديلها مع قسامات اضافيه من كوة إذا لزم الأمر.</li>
	</ol>
</li>
	<li>حصاد الخلايا المستزرعة المتزايدة في التعليق من قبل طرد بسرعة منخفضه: 136 x g لمده 6 دقائق في 4 °c. يغسل مره واحده مع الجليد الباردة تلفزيوني ، ثم يغسل لفتره وجيزة مره أخرى مع الماء البارد ، وأخيرا أعاده التعليق في 2.5 مل من الماء البارد بالاضافه إلى 400 μL 0.25 M كوة. تخلط بقوة واحتضان في 55 درجه مئوية كما هو موضح أعلاه.</li>
	<li>أضافه 160 μL من 1 M Trizma-HCl و 10 μL من 100 mM mBBr ومزيج من دوامه علي ارتفاع لمده 10 ليالي. هذا يجلب درجه الحموضة إلى ما يقرب من 8 لدعم رد فعل mBBr مع CoA الحرة. تغطيه واحتضان عينات في درجه حرارة الغرفة ل 2 ح في الظلام لل mbbr للرد مع ثيول من CoA.</li>
	<li>أضافه 100 μL من حمض الخليك وتخلط بواسطة دوامه علي ارتفاع لمده 10 ليالي لوقف رد الفعل</li>
	<li>أجهزه الطرد المركزي في 2,000 x g لمده 15 دقيقه لأزاله الحطام الخلية عجلت.</li>
	<li>أزاله وحفظ ماده طافي في أنبوب اختبار الزجاج لتنظيف العمود مهندس البترول المصري التي يرد وصفها أدناه.</li>
</ol>4. استخراج واشتقاق من CoA في الانسجه
<ol><li>تشريح قطع الانسجه الحيوانية ، حوالي 0.5 سم قطرها أو أصغر ، ولطخه لفتره وجيزة (1-2 s) علي ورقه ماصه ومن ثم تجميد فلاش في النيتروجين السائل وتخزين في-80 درجه مئوية حتى المعالجة. CoA في الانسجه هو تحلل أو تحويلها إلى ثيوستر إذا لم فلاش المجمدة. هذه الخطوة مهمة للحصول علي الحد الأقصى لمحصول CoA في الانسجه.</li>
	<li>تزن قطع الانسجه المجمدة (5-60 ملغ) بسرعة قبل بدء التحليل ، وتسجيل الوزن لكل عينه. يتم استخدام هذا التحديد الوزن الرطب لحساب محتوي CoA بعد تنقيه HPLC. تجنب الذوبان الكامل لقطع الانسجه.</li>
	<li>أضافه 2 مل من 1 مم كوة إلى أنبوب اختبار الزجاج (علي سبيل المثال ، 13 مم × 100 مم القابل للتصرف) الموجهة لادراج التحقيق واضطراب الانسجه مع الخالط الدوار الموالي. إبقاء الأنبوب علي الجليد حتى الاستخدام. ويتم ذلك للتاكد من ان العينات متجانسة في درجه حرارة بارده ولا يتم تدمير CoA بسبب الحرارة المتولدة اثناء التجانس.</li>
	<li>نقل وتجانس الانسجه (30-40 ملغ) في أنبوب اختبار الزجاج (التي تحتوي علي الباردة 1 مم كوة) لمده 30 ثانيه. تجنب الذوبان الكامل للانسجه.</li>
	<li>أضافه 500 μL من 0.25 M KOH; دوامه علي ارتفاع لمده 10 ليالي والحفاظ علي الجليد حتى يتم تجانس جميع العينات. وهذا سيجلب درجه الحموضة من العينة أعلاه 12 إلى حلعوترات CoA لإنتاج CoA الكلي (CoA الحرة + تحلل CoA ثيوترات).</li>
	<li>احتضان عينات في 55 درجه مئوية لمده 2 ح في حمام المياه دون اهتزاز لدعم التحلل المائي.</li>
	<li>أضافه 150 μL من 1 M Trizma-HCl و 10 μL من 100 mM mBBr; دوامه علي ارتفاع لمده 10 ثانيه. هذا يجلب درجه الحموضة إلى حوالي 8 لدعم رد فعل mBBr مع CoA الحرة.</li>
	<li>احتضان العينات في درجه حرارة الغرفة لمده 2 ساعة في الظلام لضمان ديريفاتيزيد جميع CoA مع mBBr.</li>
	<li>أضافه 100 μL من حمض الخليك ودوامه علي ارتفاع ل 10 ثانيه لوقف رد الفعل.</li>
	<li>أجهزه الطرد المركزي في 2,000 x g لمده 15 دقيقه إلى بيليه الحطام الخلية عجلت.</li>
	<li>أزاله وحفظ ماده طافي في أنبوب اختبار الزجاج لتنظيف العمود مهندس البترول المصري (الموصوفة أدناه).</li>
</ol>5. عينه تنظيف مع المرحلة الصلبة استخراج العمود (مهندس)
<ol><li>في درجه حرارة الغرفة ، تتوازن كل المتاح 2-(2-بيريديل)-ايثيل هلام السيليكا العمود (1 مل حجم) مع 1 مل من غسل العازلة لضمان ان المجموعة الوظيفية بيريول هو بروتيني وسوف تعمل باعتبارها المبادلة انيون. 2-(2-بيريديل)-ايثيل هلام السيليكا هو مبادل انيون ضعيفه التي هي مثاليه ل CoA-bimane في درجه الحموضة الاساسيه. 2-(2-بيريديل)-ايثيل هلام السيليكا لديه pKa من 6 ويتم التملص الحموضة ≥ 7.</li>
	<li>أضافه نموذج ماده طافي (الخطوة 4.11) إلى العمود وجمع التملص.</li>
	<li>غسل العمود مرتين مع 1 مل من غسل العازلة لأزاله اي الأنواع غير المحتفظ بها.</li>
	<li>غسل العمود مره واحده مع 1 مل من الماء.</li>
	<li>غسل العمود مرتين مع 1 مل من العازلة في أنبوب اختبار الزجاج منفصلة (12 مم × 75 مم) لجمع CoA-bimane.</li>
	<li>الجافة CoA-bimane عينه في أنبوب تحت غاز النيتروجين إلى جفاف. العينة المجففة مستقره في درجه حرارة الغرفة حتى مزيد من الاستخدام. ختم وتغطيه تماما الأنبوب ومخزن.</li>
	<li>عندما تكون جاهزه للتحليل HPLC ، أعاده التعليق عينه في 300 μL من الماء وتخلط بقوة بواسطة دوامه علي ارتفاع لمده 10 ليالي.</li>
	<li>نقل عينه أعاده تعليق إلى فلتر أنبوب الطرد المركزي (0.22 μm خلات السليلوز ، 2 مل حجم) وأجهزه الطرد المركزي في 5,000 x ز لمده 10 دقيقه لأزاله اي اندفاع.</li>
	<li>نقل عينه تصفيتها إلى قارورة زجاجيه مناسبه للحقن HPLC.</li>
</ol>6. HPLC تنقيه وقياس CoA-bimane
<ol><li>اعداد المخازن المؤقتة. العازلة A: 50 mM KH2PO4، pH 4.6 ؛ العازلة B: اسيتلونيتريل (اوبتيما الصف).</li>
	<li>السلطة حتى نظام HPLC. ملاحظه: نظام HPLC في المختبر لدينا هو e2695 المياه الفصل وحده مجهزه 2489 الاشعه فوق البنفسجية مرئية (UV-فيس) كاشف الامتصاص وكاشف الفلورية 2475 التي تسيطر عليها تمكين 3 البرمجيات. النظام لديه أيضا حاقن عينه الألى.</li>
	<li>حقن كل عينه (علي سبيل المثال ، 20 μL) للفصل علي الجوزاء C18 ، 3 μm 100 Å ، 4.6 مم × 150 مم العمود باستخدام البرنامج في الجدول 1 مع معدل تدفق 0.5 mL/min. درجه حرارة العمود هي 25 درجه مئوية. قياس الامتصاص للاشعه فوق البنفسجية/المرئية كاشف في λ 393 nm ، والكشف عن الفلورسنت في المستوي = 393 nm ، الاسم = 470 nm. يتم تحديد وقت الاستبقاء عن طريق تشغيل منحني القياسية CoA bimane قبل كل مجموعه من العينات.</li>
	<li>تسجيل المنطقة تحت قمة CoA-bimane لكل عينه وقارن مع المنحني القياسي لحساب بمول من CoA-bimane حقن علي العمود hplc. ويستخدم المنحني القياسي لامتصاص CoA-bimane لعينات الانسجه ، ويستخدم المنحني المعياري لزراعه النسيج بالنسبة لعينات الانسجه.</li>
	<li>وبما ان قيم CoA-bimane تمثل إجمالي CoA لكل عينه ، فانها تطبع إلى عدد الخلايا القابلة للحياة لعينات الثقافة ، أو الوزن الرطب mg لعينات الانسجه (الشكل 6). بدلا من ذلك ، احسب إجمالي قيم CoA بعد التطبيع إلى الحمض النووي أو محتوي البروتين لكل عينه. يمكن تحديد محتوي الحمض النووي أو البروتين بشكل منفصل باستخدام عينه من المكونات التي تتم ازالتها اثناء اعداد العينة قبل أضافه KOH.</li>
</ol>

<ol><li>Abiko, Y. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAbiko%2C+Y+%22Metabolic+Pathways%22">Metabolic Pathways</a>. Greenburg, D. M. 7, Academic Press, Inc. Ch. 7 1-25 (1975).</li>
<li>Leonardi, R., Zhang, Y. -M., Rock, C. O., Jackowski, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coenzyme+A%3A+Back+in+action%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Lipid+Research%22%5BJournal%5D)">Coenzyme A: Back in action.</a> Progress in Lipid Research. 44, 125-153 (2005).</li>
<li>Jackowski, S., Rock, C. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+coenzyme+A+biosynthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">Regulation of coenzyme A biosynthesis.</a> Journal of Bacteriology. 148, 926-932 (1981).</li>
<li>Robishaw, J. D., Berkich, D. A., Neely, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rate-limiting+step+and+control+of+coenzyme+A+synthesis+in+cardiac+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Rate-limiting step and control of coenzyme A synthesis in cardiac muscle.</a> Journal of Biological Chemistry. 257, 10967-10972 (1982).</li>
<li>Di Meo, I., Carecchio, M., Tiranti, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inborn+errors+of+coenzyme+A+metabolism+and+neurodegeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Inherited+Metabolic+Disease%22%5BJournal%5D)">Inborn errors of coenzyme A metabolism and neurodegeneration.</a> Journal of Inherited Metabolic Disease. 42, 49-56 (2019).</li>
<li>Zhou, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+pantothenate+kinase+gene+%28PANK2%29+is+defective+in+Hallervorden-Spatz+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">A novel pantothenate kinase gene (PANK2) is defective in Hallervorden-Spatz syndrome.</a> Nature Genetics. 28, 345-349 (2001).</li>
<li>Dusi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exome+sequence+reveals+mutations+in+CoA+synthase+as+a+cause+of+neurodegeneration+with+brain+iron+accumulation%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Human+Genetics%22%5BJournal%5D)">Exome sequence reveals mutations in CoA synthase as a cause of neurodegeneration with brain iron accumulation.</a> American Journal of Human Genetics. 94, 11-22 (2014).</li>
<li>Dansie, L. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physiological+roles+of+the+pantothenate+kinases%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Society+Transactions%22%5BJournal%5D)">Physiological roles of the pantothenate kinases.</a> Biochemical Society Transactions. 42, 1033-1036 (2014).</li>
<li>Leonardi, R., Rehg, J. E., Rock, C. O., Jackowski, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pantothenate+kinase+1+is+required+to+support+the+metabolic+transition+from+the+fed+to+the+fasted+state%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Pantothenate kinase 1 is required to support the metabolic transition from the fed to the fasted state.</a> PLoS ONE. 5, 11107(2015).</li>
<li>Leonardi, R., Rock, C. O., Jackowski, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pank1+deletion+in+leptin-deficient+mice+reduces+hyperglycaemia+and+hyperinsulinaemia+and+modifies+global+metabolism+without+affecting+insulin+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetologia%22%5BJournal%5D)">Pank1 deletion in leptin-deficient mice reduces hyperglycaemia and hyperinsulinaemia and modifies global metabolism without affecting insulin resistance.</a> Diabetologia. 57, 1466-1475 (2014).</li>
<li>Israel, B. C., Smith, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+acute+and+chronic+ethanol+ingestion+on+pantothenate+and+CoA+status+of+rats%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Nutrition%22%5BJournal%5D)">Effects of acute and chronic ethanol ingestion on pantothenate and CoA status of rats.</a> The Journal of Nutrition. 117, 443-451 (1987).</li>
<li>Garcia, M., Leonardi, R., Zhang, Y. M., Rehg, J. E., Jackowski, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Germline+deletion+of+pantothenate+kinases+1+and+2+reveals+the+key+roles+for+CoA+in+postnatal+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Germline deletion of pantothenate kinases 1 and 2 reveals the key roles for CoA in postnatal metabolism.</a> PLoS One. 7, 40871(2012).</li>
<li>Corbin, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Excess+coenzyme+A+reduces+skeletal+muscle+performance+and+strength+in+mice+overexpressing+human+PANK2%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Genetics+and+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Excess coenzyme A reduces skeletal muscle performance and strength in mice overexpressing human PANK2.</a> Molecular Genetics and Metabolism. 120, 350-362 (2017).</li>
<li>Shumar, S. A., Kerr, E. W., Fagone, P., Infante, A. M., Leonardi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overexpression+of+Nudt7+decreases+bile+acid+levels+and+peroxisomal+fatty+acid+oxidation+in+the+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Lipid+Research%22%5BJournal%5D)">Overexpression of Nudt7 decreases bile acid levels and peroxisomal fatty acid oxidation in the liver.</a> Journal of Lipid Research. 60, 1005-1019 (2019).</li>
<li>Shumar, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+neuron-specific+degradation+of+Coenzyme+A+models+pantothenate+kinase-associated+neurodegeneration+by+reducing+motor+coordination+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Induction of neuron-specific degradation of Coenzyme A models pantothenate kinase-associated neurodegeneration by reducing motor coordination in mice.</a> PLoS ONE. 10, 0130013(2015).</li>
<li>Zano, S. P., Pate, C., Frank, M., Rock, C. O., Jackowski, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correction+of+a+genetic+deficiency+in+pantothenate+kinase+1+using+phosphopantothenate+replacement+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Genetics+and+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Correction of a genetic deficiency in pantothenate kinase 1 using phosphopantothenate replacement therapy.</a> Molecular Genetics and Metabolism. 16, 281-288 (2015).</li>
<li>Sharma, L. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+therapeutic+approach+to+pantothenate+kinase+associated+neurodegeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">A therapeutic approach to pantothenate kinase associated neurodegeneration.</a> Nature Communications. 9, 4399(2018).</li>
<li>Alvarez-Cordoba, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pantothenate+Rescues+Iron+Accumulation+in+Pantothenate+Kinase-Associated+Neurodegeneration+Depending+on+the+Type+of+Mutation%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Pantothenate Rescues Iron Accumulation in Pantothenate Kinase-Associated Neurodegeneration Depending on the Type of Mutation.</a> Molecular Neurobiology. 56, 3638-3656 (2019).</li>
<li>Arber, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((iPSC-derived+neuronal+models+of+PANK2-associated+neurodegeneration+reveal+mitochondrial+dysfunction+contributing+to+early+disease%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">iPSC-derived neuronal models of PANK2-associated neurodegeneration reveal mitochondrial dysfunction contributing to early disease.</a> PLoS One. 12, 0184104(2017).</li>
<li>Di Meo, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acetyl-4%27-phosphopantetheine+is+stable+in+serum+and+prevents+phenotypes+induced+by+pantothenate+kinase+deficiency%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Acetyl-4'-phosphopantetheine is stable in serum and prevents phenotypes induced by pantothenate kinase deficiency.</a> Scientific Reports. 7, 11260(2017).</li>
<li>Nishikawa, T., Edelstein, D., Brownlee, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+missing+link%3A+a+single+unifying+mechanism+for+diabetic+complications%5BTitle%5D)+AND+%22Kidney+International+Supplements%22%5BJournal%5D)">The missing link: a single unifying mechanism for diabetic complications.</a> Kidney International Supplements. 77, 26-30 (2000).</li>
<li>Tsuchiya, Y., Pham, U., Gout, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+measuring+CoA+and+CoA+derivatives+in+biological+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Society+Transactions%22%5BJournal%5D)">Methods for measuring CoA and CoA derivatives in biological samples.</a> Biochemical Society Transactions. 42, 1107-1111 (2014).</li>
<li>Demoz, A., Netteland, B., Svardal, A., Mansoor, M. A., Berge, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Separation+and+Detection+of+Tissue+Coash+and+Long-Chain+Acyl-Coa+by+Reversed-Phase+High-Performance+Liquid-Chromatography+after+Precolumn+Derivatization+with+Monobromobimane%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Chromatography%22%5BJournal%5D)">Separation and Detection of Tissue Coash and Long-Chain Acyl-Coa by Reversed-Phase High-Performance Liquid-Chromatography after Precolumn Derivatization with Monobromobimane.</a> Journal of Chromatography. 635, 251-256 (1993).</li>
<li>Shimada, K., Mitamura, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Derivatization+of+Thiol-Containing+Compounds%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Chromatography+B%22%5BJournal%5D)">Derivatization of Thiol-Containing Compounds.</a> Journal of Chromatography B. 659, 227-241 (1994).</li>
<li>Minkler, P. E., Kerner, J., Ingalls, S. T., Hoppel, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+isolation+procedure+for+short-%2C+medium-%2C+and+long-chain+acyl-coenzyme+A+esters+from+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Novel isolation procedure for short-, medium-, and long-chain acyl-coenzyme A esters from tissue.</a> Analytical Biochemistry. 376, 275-276 (2008).</li>
<li>Newton, G. L., Fahey, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+biothiols+by+bromobimane+labeling+and+high-performance+liquid+chromatography%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Determination of biothiols by bromobimane labeling and high-performance liquid chromatography.</a> Methods in Enzymology. 251, 148-166 (1995).</li>
<li>Radkowsky, A. E., Kosower, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bimanes+.17.+%28Haloalkyl%29-1%2C5-Diazabicyclo%5B3.3.0%5DOctadienediones+%28Halo-9%2C10-Dioxabimanes%29+-+Reactivity+toward+the+Tripeptide+Thiol%2C+Glutathione%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Bimanes .17. (Haloalkyl)-1,5-Diazabicyclo[3.3.0]Octadienediones (Halo-9,10-Dioxabimanes) - Reactivity toward the Tripeptide Thiol, Glutathione.</a> Journal of the American Chemical Society. 108, 4527-4531 (1986).</li>
<li>Zhang, Y. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+knockout+of+pantothenate+kinase+reveals+the+metabolic+and+genetic+program+responsible+for+hepatic+coenzyme+A+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Chemistry+%26+Biology%22%5BJournal%5D)">Chemical knockout of pantothenate kinase reveals the metabolic and genetic program responsible for hepatic coenzyme A homeostasis.</a> Chemistry & Biology. 14, 291-302 (2007).</li>
<li>Tokutake, Y., Onizawa, N., Katoh, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toyoda+A%2CChohnan+S.+Coenzyme+A+and+its+thioester+pools+in+fasted+and+fed+rat+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">Toyoda A,Chohnan S. Coenzyme A and its thioester pools in fasted and fed rat tissues.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 402, 158-162 (2010).</li>
<li>Shibata, K., Nakai, T., Fukuwatari, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+high-performance+liquid+chromatography+determination+of+coenzyme+A%2C+dephospho-coenzyme+A%2C+and+acetyl-coenzyme+A+in+normal+and+pantothenic+acid-deficient+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Simultaneous high-performance liquid chromatography determination of coenzyme A, dephospho-coenzyme A, and acetyl-coenzyme A in normal and pantothenic acid-deficient rats.</a> Analytical Biochemistry. 430, 151-155 (2012).</li>
<li>Chohnan, S., Takamura, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+micromethod+for+measurement+of+CoASH+and+its+use+in+measuring+the+intracellular+levles+of+CoASH+and+short+chain+acyl-CoAs+in+Escherichia+coli+K12+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Agricultural+and+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">A simple micromethod for measurement of CoASH and its use in measuring the intracellular levles of CoASH and short chain acyl-CoAs in Escherichia coli K12 cells.</a> Agricultural and Biological Chemistry. 55, 87-94 (1991).</li>
</ol>

كتبت MWF ، CS و SJ الورقة ، MWF و CS قدمت البيانات والأرقام ، كور تصميم التجارب ومراجعتها بشكل نقدي المخطوطة. SJ و COR هي المخترعين علي طلب براءات الاختراع المعلقة (PCT/US17/39037) "جزيئات جزيء صغيره من المكورات بانتوثينات" التي عقدتها مستشفي سانت جود للبحوث الأطفال التي تغطي المجمع 2891 المشار اليها في هذه المقالة.

هنا نظهر اجراء موثوق به ، خطوه بخطوه لقياس إجمالي CoA في الخلايا والانسجه الحيوانية مع مجموعه واسعه من الكشف الخطي التي يمكن الوصول اليها في العديد من المختبرات التي لديها HPLC مع اما الامتصاص أو فلوري كاشف الإنتاج. وبدلا من ذلك ، فان قياس الطيف الكتلي هو أسلوب شائع لتقييم شهادة الاصاله والتوثيق ، ولكنه ليس متاحا علي نطاق واسع بسبب تكلفه الاجهزه والمعارف المتخصصة اللازمة لتطوير المنهجية وتفسير البيانات. المسمية بالنظائر CoA التي هي مناسبه للاستخدام كمعيار داخلي للقياس الكمي من CoA الحرة في الطيف الكتلي ليست متاحه تجاريا ...

انزيم A (CoA) هو عامل مساعد أساسي في جميع الكائنات الحية ويتم توليفها من حمض الثنائية ، وتسمي أيضا بانتوثينات (الملح من حمض الثنائي) أو فيتامين B5. CoA هو الناقل الرئيسي داخل الخلايا من الأحماض العضوية ، بما في ذلك الأحماض القصيرة السلسلة مثل خلات والسكينات ، فرع سلسله الأحماض مثل بروبيونات وميثيل مالوناتي ، الأحماض الدهنية طويلة السلسلة مثل بالميتات والأوليات ، والأحماض الدهنية طويلة السلسلة جدا مثل الأحماض الدهنية غير المشبعة ، و xenobiotics مثل حمض فالبرويك. يشكل الحامض عضويه [ثيوستر] ربط انزيمي مع [CoA] ان يمكن استعماله كركيزة في علي 100 رد فعل في وسيطه أيض1. هي أيضا المنظمين تفارغي والمنشطات الناقلة. هو الآن يقدر2 ان الخلوية إجماليه [CoA] نظمت إمداد تموين3,4; التالي ، يمكن ان يكون الحد من توافر CoA ، وان نقص CoA يمكن ان تكون كارثية ، كما يتمثل في الاضطرابات الوراثية الموروثة التي تؤثر علي التخليق الحيوي CoA5. بانتوثينات كيناز يحفز الخطوة الاولي في التخليق الحيوي CoA (الشكل 1) و بانتوثينات العصبية المرتبطة المقترنة ، ودعا pkan ، هو سبب الطفرات في الجينات PANK2 6. CoA synthase ، المشفرة من قبل جين Coasyn ، يحفز الخطوتين الأخيرتين في التخليق الحيوي coa (الشكل 1) و Coasy البروتين المرتبطة نيوروتنكس ، ودعا copan ، هو سبب طفرة في الجينات coasyn 7. كل من PKAN و CoPAN موروثه الامراض العصبية المرتبطة بتراكم الحديد في الدماغ ونقص CoA بشكل سلبي امراض المرض.
المستويات الخلوية من مجموع CoA تختلف بين الانسجه8 ومجموع coa يمكن زيادة أو نقصان تحت مجموعه متنوعة من الولايات الفسيولوجية والمرضية والدوائية. الكبد الزيادات coa اثناء التبديل الوقود من بنك الاحتياطي الفيدرالي إلى الدولة صام9، ومستويات coa الكبد هي عاليه بشكل غير طبيعي في الفئران البدناء ناقص ليبتين ،10. انخفاض CoA الكبد استجابه لابتلاع الايثانول المزمن11. مستويات CoA الدماغ في نموذج الماوس Pank2 الضربة القاضية هي الاكتئاب خلال فتره ما قبل الولادة ، ولكن في وقت لاحق في الدماغ مرحله الكبار coa المحتوي يعادل مستويات البرية ، مما يدل علي استجابه CoA التكيف اثناء التطوير12. التلاعب في محتوي CoA الانسجه عن طريق التكوين أو الجينات طرق التسليم تؤثر علي وظائف الأيض والعصبية13،14،15. التطوير الإكلينيكي للعلاجات المحتملة لل pkan أو كوبان يتضمن قياسات الخلايا أو الانسجه CoA كمؤشرات للفعالية16،17،18،19،20 . يتطلب تقييم كل هذه الشروط ونتائجها الايضيه أو الوظيفية طريقه كميه لقياس مجموع CoA.
ويعد الفحص الدقيق والموثوق لقياس CoA في العينات البيولوجية تحديا تقنيا في العديد من المختبرات. لسوء الحظ ، لا توجد تحقيقات متاحه لتقييم أو قياس CoA أو CoA ثيوترات في الخلايا السليمة ، علي الرغم من ان النظير من الطبيعية CoA thioesters وقد استخدمت علي نطاق واسع كتحقيقات ميكانيكيه في دراسات CoA استر استخدام الانزيمات21. التحويل من CoA, مع [سلفهيدراريل] حره (-[ش]) [موليتي], إلى [CoA] [ثيوستر] (أو العكس) سريعة في خلايا أو نسيج حيوانيه اثناء انتقال إلى بيئة مختلفه واثناء خليه تحلل. العديد من acyl-CoA synthetases و acyl-CoA thioesterases في الخلايا توسط التحويلات داخل تجمع CoA ، والانزيمات الاضافيه التي تستخدم CoA ثيوترات كما ركائز تبقي نشطه في عينات بيولوجية حتى مروي من قبل الكيميائية أو الفيزيائية يعني. التحميل من acyl-المجموعات من CoA إلى كارنيتين بواسطة المحولات acyl هو مثال واحد داخل شبكه من ردود الفعل التي يمكن ان تغير من CoA/CoA التوزيع thioester. يمكن استخدام المتعقبات المشعة لقياس معدلات توليف CoA في الخلايا. وقد تم استعراض الأساليب الحالية لقياس مشتقات CoA و CoA في العينات البيولوجية22 وتشمل المقايسات الطيفية الانزيميه المقترنة ، والفصل اللوني السائل عالي الضغط والإجراءات القائمة علي الطيف الكتلي. ومع ذلك ، غالبا ما تتركز هذه الأساليب علي الأنواع الجزيئية الخاصة CoA وهي عمياء إلى الاختلاف من تجمع CoA الكلي. الاختبارات الانزيميه المقترنة تتطلب عموما كميات أكبر من مواد الإدخال بسبب الحساسيات الكشف المنخفضة ولها مجموعه محدوده من الخطي.
وقد وضعت لدينا مختبر اجراء موثوق بها للقياس الكمي لمجموع CoA في الخلايا المستزرعة والانسجه الحيوانية. وتشمل الاستراتيجية التحلل المائي لجميع ثيوترات CoA لإنتاج CoA الحرة فقط خلال اعداد العينة ، بدلا من بذل الجهود للحفاظ علي وتحليل الطيف بأكمله من الأنواع CoA. هذا الاجراء هو تجميع للأساليب المنشورة الفردية لاعداد العينة ، CoA اشتقاق ، تنقيه وتحديد بعد اللوني السائل عاليه الضغط (HPLC) ، والتقدير الكمي لديريفاتيزيد CoA عن طريق الامتصاص أو الكشف عن الفلورية23،24،25. وقد مكنت القرارات CoA التي تم الحصول عليها باستخدام هذا الاجراء فهمنا لتنظيم CoA وتطوير نهج علاجي لعلاج نقص CoA.

<table><tbody><tr><td>2- (2-بيريديل) -إيثيل هلام السيليكا SPE عمود</td><td>Millipore-Sigma</td><td>54127-U</td><td></td></tr><tr><td>الإنزيم المساعد أفانتي</td><td>القطبية</td><td>870700</td><td></td></tr><tr><td>الجوزاء C18 3 & mu ؛ م 100 & أرينج; عمود HPLC</td><td>Phenomenex</td><td>00F-4439-E0</td><td></td></tr><tr><td>monobromobimane</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>M-1378</td><td></td></tr><tr><td>Omni-Tip مزعج الأنسجة</td><td>المسبار Omni International</td><td>32750H</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Fisher</td><td>S37440</td><td></td></tr><tr><td>PowerGen 125 الخالط الجزء الثابت الدوار الآلي</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>NC0530997</td><td></td></tr><tr><td>Spin-X مرشح أنبوب الطرد المركزي</td><td>CoStar</td><td>8161</td><td></td></tr><tr><td>Trizma-HCl</td><td>Fisher</td><td>T395-1</td><td></td></tr><tr><td>Waters 2475 كاشف مضان</td><td>Waters</td><td>2475</td><td></td></tr><tr><td>Waters 2489 كاشف UV-Vis</td><td>Waters</td><td>2489</td><td></td></tr><tr><td>Waters e2695 وحدة الفصل</td><td>Waters</td><td>e2695</td><td></td></tr></tbody></table>

القياس الكمي لانزيم a في الخلايا والانسجه

Quantification of Coenzyme A in Cells and Tissues

وقد كشفت البحوث الناشئة ان الانزيم الخلوي A (CoA) العرض يمكن ان تصبح الحد مع تاثير ضار علي النمو, التمثيل الغذائي والبقاء علي قيد الحياة. قياس CoA الخلوية هو التحدي بسبب وفره منخفضه نسبيا والتحويل الديناميكي لل CoA الحرة إلى ثيوترات CoA التي ، بدورها ، والمشاركة في العديد من ردود الفعل الايضيه. يتم وصف الأسلوب الذي يتنقل من خلال المزالق المحتملة اثناء اعداد العينة للحصول علي فحص مع مجموعه خطيه واسعه من الكشف التي هي مناسبه للاستخدام في العديد من المختبرات الطبية الحيوية.

وقد تم تطوير طريقه سريعة وموثوق بها نسبيا للكشف عن مجموع coa في الخلايا والانسجه مثقف من قبل نظر ثيول من coa إلى وكيل الفلورسنت باستخدام mbbr ، ومن ثم تنقيه ديريفاتيزيد coa-bimane باستخدام المرحلة العكسية hplc. يتم إنشاء منحني قياسي لأول مره ، حيث يتم حقن كميات معروفه ومتزايدة من معيار CoA-bimane بشكل فردي ويتم رسم المناطق تحت القمم في اللونية CoA-bimane كداله للمدخلات CoA-bimane (الشكل 4). CoA-bimane لديه اقصي امتصاص في λ 393 nM ويظهر الملف الشخصي HPLC ممثل الوقت الاحتفاظ من معيار CoA-biman...

يصف هذا الأسلوب اعداد العينات من الخلايا المستزرعة والانسجه الحيوانية ، واستخراج واشتقاق انزيم A في العينات ، تليها اللوني السائل عاليه الضغط لتنقيه والتقدير الكمي لانزيم ديريفاتيزيد A من قبل الامتصاص أو الكشف عن الفلورية.

القياس الكمي لانزيم A في الخلايا والانسجه

Emerging research has revealed that the cellular coenzyme A (CoA) supply can become limiting with a detrimental impact on growth, metabolism and survival. ...

إنزيم A، يسمى CoA لفترة قصيرة، هو عامل مساعد مهم في التمثيل الغذائي الخلوي. تكشف القياسات الكمية عن التغيرات التي تحدث مع الحالات الغذائية والهرمونية في النماذج الحيوانية. هذه الطريقة كميات كمية إجمالية من CoA الخلوية, بما في ذلك مشتقات COA و COA الحرة, في طريقة بسيطة وموثوق بها.ترتبط عدة أنواع من التنكس العصبي مع تراكم الحديد الدماغ مع الطفرات في جينات مسار COA التركيب الحيوي. يمكن تطبيق هذه الطريقة على أي نظام بيولوجي لأن جميع الكائنات الحية تتطلب CoA للبقاء والنمو والوظيفة. قد يعاني الباحث لأول مرة من الخطوات الأولى في إعداد العينات ، حيث من المهم الحفاظ على العينات باردة تمامًا ثم نقلها بسرعة إلى هيدروكسيد البوتاسيوم.الحد من عدد العينات في دفعة قبل نقلها إلى هيدروكسيد البوتاسيوم، وممارسة مع نقل قبل العمل مع العينات التجريبية. العديد من الباحثين لا تعرف على استخراج المرحلة الصلبة في إعداد العينات البيولوجية لتحليل البيوكيميائية في وقت لاحق. لتبدأ، احتضان الأطباق ثقافة ثلاثية في موازاة، اثنان للتحليل الكيميائي الحيوي واحد لتحديد عدد الخلايا قابلة للحياة.عندما تقترب الثقافة من الكثافات غير ذات القدرة على الوفرة المتأخرة ، على سبيل المثال ، تنمو خلايا HepG2 /C3A البشرية إلى كثافة 6 إلى 8 مرات 10 إلى الخلايا الست أو خلايا HEK 293T التي نمت إلى كثافة حوالي 1.3 مرة 10 إلى سبعة لكل طبق 100 ملليمتر ، حصاد الخلايا الملتزمة في الثقافة. ثم، إضافة ملليلتر واحد من الماء البارد الجليد إلى طبق الثقافة نفسه. كشط الخلايا في الماء البارد في الطبق، ونقل تعليق الخلية إلى أنبوب اختبار الزجاج التي تحتوي على 400 ميكرولتر من هيدروكسيد البوتاسيوم 0.25 المولار و 1.5 ملليلتر من الماء لجلب درجة الHH فوق 12.اخلطي التعليق بقوة من خلال الارتفاع لمدة 10 ثوانٍ. ثم تغطية بإحكام مع فيلم البارافين، واحتضان في 55 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة دون أن تهتز في حمام مائي. ثم، إضافة 160 ميكرولترات من مولر واحد Trizma-هيدروكلوريد حل و 10 ميكرولترات من 100 ملليمولار mBBr.مزيج من دوامة على ارتفاع لمدة 10 ثانية. وهذا يجعل درجة حُكّة الـ 8 تقريبًا لدعم رد فعل mBBr مع COA المجاني. تغطية أنبوب مع فيلم البارافين، واحتضان العينات في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعتين في الظلام ل mBBr للرد مع ثيول من CoA.بعد ساعتين، إضافة 100 ميكرولترات من حمض الخليك، ومزيج من دوامة لمدة 10 ثانية لوقف رد الفعل. تتشكل الأمطار في الأنبوب. بعد ذلك، الطرد المركزي في 2،000 مرات ز لمدة 15 دقيقة.لإزالة حطام الخلية المترسبة، نقل وحفظ المابير في أنبوب اختبار الزجاج لتنظيف عمود الاستخراج الصلبة المرحلة. قبل بدء التحليل، أضف ميليتين من هيدروكسيد البوتاسيوم بمليمتر واحد إلى أنبوب اختبار زجاجي مصمم لإدراج مسبار واختلال الأنسجة مع مُتجانس دوار. إبقاء أنبوب على الجليد حتى استخدامها.وزن قطع الأنسجة المجمدة بسرعة، وتسجيل الوزن الرطب لكل عينة. نقل الأنسجة إلى أنبوب زجاجي، وتجانس الأنسجة لمدة 30 ثانية. تجنب ذوبان الأنسجة بالكامل.إضافة 500 ميكرولترات من 0.25-المولار هيدروكسيد البوتاسيوم. دوامة عالية لمدة 10 ثانية، والحفاظ على الجليد. وهذا يجلب للhH من العينة فوق 12 إلى hydrolyze الثيوقارات COA إلى العائد الإجمالي COA.تغطية أنبوب مع فيلم البارافين. إعداد الخلايا المستزرعة وإعداد الأنسجة هي الخطوات الأكثر أهمية في هذا الإجراء. من المهم إضافة هيدروكسيد البوتاسيوم العالي بسرعة لمنع تدهور COA.احتضان العينات في 55 درجة مئوية لمدة ساعتين في حمام مائي دون اهتزاز لدعم التحلل المائي. ثم، إضافة 150 ميكرولتردات من واحد المولر تريزما هيدروكلوريد و 10 ميكرولترات من 100 ملليمولار mBBr لتحقيق درجة حزو إلى حوالي ثمانية لدعم رد فعل mBBr مع COA الحرة. دوامة عالية لمدة 10 ثوان.تغطية أنبوب مع فيلم البارافين، واحتضان العينات في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعتين في الظلام لضمان اشتقاق جميع COA مع mBBr. بعد ذلك ، أضف 100 ميكرولترات من حمض الخليك ، ودوة عالية لمدة 10 ثوان لوقف التفاعل. أجهزة الطرد المركزي في 2،000 مرات ز لمدة 15 دقيقة لبيدة ترسب الحطام الخلية، ونقل المابير إلى أنبوب اختبار الزجاج لتنظيف عمود استخراج المرحلة الصلبة.في درجة حرارة الغرفة، توازن كل ملليلتر واحد يمكن التخلص منه 2-2-بيريديل-الإيثيل هلام العمود مع ملليلتر واحد من عازلة غسل لضمان أن مجموعة بيريديل وظيفية هو بروتون وسوف تعمل كمبادل أنيون. ثم، ماصة العينة افرا على العمود، وجمع eluate. غسل العمود مرتين مع ملليلتر واحد من العازلة غسل ومرة واحدة مع ملليلتر واحد من الماء لإزالة أي الأنواع غير المطهرة.بعد ذلك ، في أنبوب اختبار زجاجي منفصل ، قم بغسل العمود مرتين بميليلتر واحد من عازلة elution لجمع CoA-bimane. جفف عينة CoA-bimane في الأنبوب تحت غاز النيتروجين. ختم، وتغطية تماما الأنبوب، وتخزينها في ناقص 20 درجة مئوية.عندما تكون جاهزة لتحليل HPLC، قم بإعادة تعليق العينة في 300 ميكرولترات من الماء، واخلط بقوة من خلال الدوامة العالية لمدة 10 ثوانٍ. نقل العينة التي تم إعادة تعليقها إلى فلتر أنبوب الطرد المركزي، والطرد المركزي بمعدل 5000 مرة ز لمدة 10 دقائق لإزالة أي متعجل. ثم، نقل العينة التي تمت تصفيتها إلى قارورة زجاجية مناسبة لحقن HPLC.في هذه الدراسة، يعرض ملف HPLC التمثيلي وقت الاحتفاظ بمعيار CoA-bimane على عمود HPLC C18. تم حقن كميات متزايدة من معيار CoA-bimane بشكل فردي، وتم رسم المناطق الواقعة تحت القمم في الكروماتوغرامات CoA-bimane كدالة لمدخل CoA-bimane. عكس المنحنى القياسي حجم الامتصاص من CoA-bimane في طول موجة من 393 نانومتر.كما انعكس الفلور من CoA-bimane في الطول الموجي إثارة من 393 نانومتر والطول الموجي للانبعاثات من 470 نانومتر. ويشار إلى فصل HPLC اللاحقة وملامح الكشف النموذجية عن كبد الماوس أو خلايا C3A البشرية المستزرعة هنا من خلال القمم الحمراء ، مع وقت الاحتفاظ بين 11 و 12 دقيقة باستخدام برنامج elution. إذا كان رد الفعل مع mBBr لا تسفر عن نتائج يمكن الكشف عنها، قد تحتاج كمية من Trizma-HCl إلى تعديل لخفض درجة ح H إلى ما يقرب من ثمانية.من الممكن الكشف عن جزيئات خلوية إضافية تحتوي على sulfhydryl أو ثيوستر مويتيس كمشتقات ثنائية. على سبيل المثال، الجلوتاثيون-bimane يمكن الكشف عن طريقة HPLC. هذه التقنية سوف تسمح للباحثين الآخرين للتحقيق في الدور المحتمل للخلل في التوازن العصبي المرتبطة بالخلل الأيضي، مثل النماذج الحيوانية من مرض السكري من النوع 2.يجب على الباحثين استخدام معدات الحماية الشخصية عند العمل مع المذيبات العضوية المستخدمة لاستخراج المرحلة الصلبة.

quantification-of-coenzyme-a-in-cells-and-tissues

Research

JoVE Journal

Biochemistry

الكيمياء الحيوية

يوضح هذا الفيديو تقنية القياس الكمي لثاني أكسيد الكربون2 المنبعث أثناء أكسدة الركيزة باستخدام 14ركيزة ذات علامات إشعاعية C. يتم احتجاز 14ثاني أكسيد الكربونالذي تم إطلاقه في محلول قلوي ويتم قياسه كميا بواسطة عداد التلألؤ. تختلف أكسدة الركائز المختلفة بين الأنسجة وتعكس الحالة الفيزيولوجية المرضية للأنسجة.

فحص أكسدة الركيزة في الخلايا المستنبتة: اختبار في المختبر لتحديد أكسدة الركيزة في الخلايا عن طريق قياس الإشارات المشعة من ثاني أكسيد الكربونالمحاصر 2

يوضح هذا الفيديو تقنية في المختبر لتقييم التوافر البيولوجي للحديد في مصادر الغذاء المعقدة. تجمع هذه التقنية بين محاكاة الهضم البشري مع امتصاص الحديد بواسطة خلايا Caco-2 المتمايزة. يعمل تكوين الفيريتين داخل الخلايا كعلامة لامتصاص الحديد الخلوي.

الاختبار الحيوي لخلايا Caco-2: طريقة في المختبر لقياس التوافر البيولوجي للحديد في مصادر الغذاء المعقدة

ترتبط مستويات الهيم المتغيرة داخل الخلايا بأمراض شائعة مثل السرطان. وبالتالي ، هناك حاجة لقياس مستويات التخليق الحيوي للهيم في خلايا متنوعة. الهدف من هذا البروتوكول هو توفير طريقة سريعة وحساسة لقياس ومقارنة مستويات تخليق الهيم في الخلايا المختلفة.

قياس مستويات هيم في تخليق خلايا الثدييات

نحن هنا تظهر الصفائح الدموية البشرية معزولة يمكن استخدامها بوصفها الوصول فيفو السابقين نموذج لدراسة التعديلات التمثيل الغذائي ردا على مجمع أنا المانع روتينون. هذا النهج يعمل تتبع النظائر وتقدير نسبي من قبل السائل الطيف اللوني الشامل ويمكن تطبيقها على مجموعة متنوعة من التصاميم الدراسة.

LC-MS تحليل الصفائح الدموية البشرية باعتبارها منصة لدراسة الميتوكوندريا الأيض

الأحماض الدهنية β الأكسدة هو مسار استقلابي أساسي مسؤول عن توليد الطاقة في العديد من أنواع الخلايا المختلفة ، بما في ذلك خلايا الكبد. هنا ، نصف طريقة لقياس أكسدة β الأحماض الدهنية في خلايا الكبد الأولية المعزولة حديثا باستخدام 14حمض بالمتيك المسمى C.

قياس الأحماض الدهنية β الأكسدة في تعليق خلايا الكبد الفئران المعزولة حديثا

يصف هذا البروتوكول فحصا مقارنا ، باستخدام أنشطة الميتوكوندريا المعقدة CI + CIII و CII + CIII في وجود أو عدم وجود Na + ، لدراسة وجود تجمعات CoQ وظيفية مجزأة جزئيا.

تكشف حساسية غشاء الميتوكوندريا الداخلي ل Na+ عن برك CoQ وظيفية مجزأة جزئيا

يمثل الفحص الحيوي لخلايا Caco-2 للتوافر البيولوجي للحديد (Fe) نهجا فعالا من حيث التكلفة ومتعدد الاستخدامات لتقييم التوافر البيولوجي للحديد من الأطعمة والمنتجات الغذائية والمكملات الغذائية والوجبات وحتى أنظمة النظام الغذائي. تم التحقق من صحته بدقة للدراسات البشرية ، وهو يمثل أحدث ما توصلت إليه دراسات التوافر البيولوجي Fe.

المقايسة الحيوية لخلايا Caco-2 لقياس التوافر البيولوجي للحديد الغذائي

تم تحضير كرويات الورم 3D متعددة الخلايا مع خلايا الورم الغدي الرئوي ، والخلايا الليفية ، والوحيدات ، تليها عزل الخلايا الليفية المرتبطة بالسرطان (CAFs) من هذه الكرويات. تمت مقارنة CAFs المعزولة مع الخلايا الليفية الطبيعية لتقييم صحة الميتوكوندريا من خلال دراسة إمكانات الغشاء عبر الميتوكوندريا ، وأنواع الأكسجين التفاعلية ، والأنشطة الأنزيمية.

تقييم صحة الميتوكوندريا في الخلايا الليفية المرتبطة بالسرطان المعزولة من كرويات ورم الرئة متعدد الخلايا 3D

تعكس الحالة الأيضية للخلايا الظهارية الصبغية في شبكية العين البشرية (H-RPE) صحتها ووظيفتها. يظهر هنا بروتوكول محسن لفحص التدفق الأيضي في الوقت الفعلي ل H-RPE باستخدام قياس التنفس عالي الدقة.

تحليل في الوقت الحقيقي للطاقة الحيوية في الخلايا الظهارية الصبغية الشبكية البشرية الأولية باستخدام قياس التنفس عالي الدقة

يوضح هذا البروتوكول بالتفصيل مقايسة في المختبر لقياس امتصاص الدهون الخلوية في الخلايا البطانية عند التحفيز باستخدام نظائر الفلورسنت BODIPY-C12 و BODIPY-C16 للأحماض الدهنية المشبعة طويلة السلسلة وطويلة السلسلة. هذه الطريقة فعالة وقابلة للتكيف مع أنواع الخلايا الأخرى ، مما يوفر نهجا مفيدا لدراسة التمثيل الغذائي للدهون.

القياس الكمي لامتصاص الأحماض الدهنية البطانية باستخدام نظائر الأحماض الدهنية الفلورية

تعلم قياس إنزيم أ في الخلايا والأنسجة باستخدام كروماتوغرافيا السائل عالي الضغط. هذه الطريقة الموثوقة تساعد الباحثين على دراسة التمثيل الغذائي والتنكس العصبي.

القياس الكمي لانزيم A في الخلايا والانسجه

استكشف المزيد من الفيديوهات