القياس الكمي لانزيم A في الخلايا والانسجه

إنزيم A، يسمى CoA لفترة قصيرة، هو عامل مساعد مهم في التمثيل الغذائي الخلوي. تكشف القياسات الكمية عن التغيرات التي تحدث مع الحالات الغذائية والهرمونية في النماذج الحيوانية. هذه الطريقة كميات كمية إجمالية من CoA الخلوية, بما في ذلك مشتقات COA و COA الحرة, في طريقة بسيطة وموثوق بها.

ترتبط عدة أنواع من التنكس العصبي مع تراكم الحديد الدماغ مع الطفرات في جينات مسار COA التركيب الحيوي. يمكن تطبيق هذه الطريقة على أي نظام بيولوجي لأن جميع الكائنات الحية تتطلب CoA للبقاء والنمو والوظيفة. قد يعاني الباحث لأول مرة من الخطوات الأولى في إعداد العينات ، حيث من المهم الحفاظ على العينات باردة تمامًا ثم نقلها بسرعة إلى هيدروكسيد البوتاسيوم.

الحد من عدد العينات في دفعة قبل نقلها إلى هيدروكسيد البوتاسيوم، وممارسة مع نقل قبل العمل مع العينات التجريبية. العديد من الباحثين لا تعرف على استخراج المرحلة الصلبة في إعداد العينات البيولوجية لتحليل البيوكيميائية في وقت لاحق. لتبدأ، احتضان الأطباق ثقافة ثلاثية في موازاة، اثنان للتحليل الكيميائي الحيوي واحد لتحديد عدد الخلايا قابلة للحياة.

عندما تقترب الثقافة من الكثافات غير ذات القدرة على الوفرة المتأخرة ، على سبيل المثال ، تنمو خلايا HepG2 /C3A البشرية إلى كثافة 6 إلى 8 مرات 10 إلى الخلايا الست أو خلايا HEK 293T التي نمت إلى كثافة حوالي 1.3 مرة 10 إلى سبعة لكل طبق 100 ملليمتر ، حصاد الخلايا الملتزمة في الثقافة. ثم، إضافة ملليلتر واحد من الماء البارد الجليد إلى طبق الثقافة نفسه. كشط الخلايا في الماء البارد في الطبق، ونقل تعليق الخلية إلى أنبوب اختبار الزجاج التي تحتوي على 400 ميكرولتر من هيدروكسيد البوتاسيوم 0.25 المولار و 1.5 ملليلتر من الماء لجلب درجة الHH فوق 12.

اخلطي التعليق بقوة من خلال الارتفاع لمدة 10 ثوانٍ. ثم تغطية بإحكام مع فيلم البارافين، واحتضان في 55 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة دون أن تهتز في حمام مائي. ثم، إضافة 160 ميكرولترات من مولر واحد Trizma-هيدروكلوريد حل و 10 ميكرولترات من 100 ملليمولار mBBr.

مزيج من دوامة على ارتفاع لمدة 10 ثانية. وهذا يجعل درجة حُكّة الـ 8 تقريبًا لدعم رد فعل mBBr مع COA المجاني. تغطية أنبوب مع فيلم البارافين، واحتضان العينات في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعتين في الظلام ل mBBr للرد مع ثيول من CoA.

بعد ساعتين، إضافة 100 ميكرولترات من حمض الخليك، ومزيج من دوامة لمدة 10 ثانية لوقف رد الفعل. تتشكل الأمطار في الأنبوب. بعد ذلك، الطرد المركزي في 2،000 مرات ز لمدة 15 دقيقة.

لإزالة حطام الخلية المترسبة، نقل وحفظ المابير في أنبوب اختبار الزجاج لتنظيف عمود الاستخراج الصلبة المرحلة. قبل بدء التحليل، أضف ميليتين من هيدروكسيد البوتاسيوم بمليمتر واحد إلى أنبوب اختبار زجاجي مصمم لإدراج مسبار واختلال الأنسجة مع مُتجانس دوار. إبقاء أنبوب على الجليد حتى استخدامها.

وزن قطع الأنسجة المجمدة بسرعة، وتسجيل الوزن الرطب لكل عينة. نقل الأنسجة إلى أنبوب زجاجي، وتجانس الأنسجة لمدة 30 ثانية. تجنب ذوبان الأنسجة بالكامل.

إضافة 500 ميكرولترات من 0.25-المولار هيدروكسيد البوتاسيوم. دوامة عالية لمدة 10 ثانية، والحفاظ على الجليد. وهذا يجلب للhH من العينة فوق 12 إلى hydrolyze الثيوقارات COA إلى العائد الإجمالي COA.

تغطية أنبوب مع فيلم البارافين. إعداد الخلايا المستزرعة وإعداد الأنسجة هي الخطوات الأكثر أهمية في هذا الإجراء. من المهم إضافة هيدروكسيد البوتاسيوم العالي بسرعة لمنع تدهور COA.

احتضان العينات في 55 درجة مئوية لمدة ساعتين في حمام مائي دون اهتزاز لدعم التحلل المائي. ثم، إضافة 150 ميكرولتردات من واحد المولر تريزما هيدروكلوريد و 10 ميكرولترات من 100 ملليمولار mBBr لتحقيق درجة حزو إلى حوالي ثمانية لدعم رد فعل mBBr مع COA الحرة. دوامة عالية لمدة 10 ثوان.

تغطية أنبوب مع فيلم البارافين، واحتضان العينات في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعتين في الظلام لضمان اشتقاق جميع COA مع mBBr. بعد ذلك ، أضف 100 ميكرولترات من حمض الخليك ، ودوة عالية لمدة 10 ثوان لوقف التفاعل. أجهزة الطرد المركزي في 2،000 مرات ز لمدة 15 دقيقة لبيدة ترسب الحطام الخلية، ونقل المابير إلى أنبوب اختبار الزجاج لتنظيف عمود استخراج المرحلة الصلبة.

في درجة حرارة الغرفة، توازن كل ملليلتر واحد يمكن التخلص منه 2-2-بيريديل-الإيثيل هلام العمود مع ملليلتر واحد من عازلة غسل لضمان أن مجموعة بيريديل وظيفية هو بروتون وسوف تعمل كمبادل أنيون. ثم، ماصة العينة افرا على العمود، وجمع eluate. غسل العمود مرتين مع ملليلتر واحد من العازلة غسل ومرة واحدة مع ملليلتر واحد من الماء لإزالة أي الأنواع غير المطهرة.

بعد ذلك ، في أنبوب اختبار زجاجي منفصل ، قم بغسل العمود مرتين بميليلتر واحد من عازلة elution لجمع CoA-bimane. جفف عينة CoA-bimane في الأنبوب تحت غاز النيتروجين. ختم، وتغطية تماما الأنبوب، وتخزينها في ناقص 20 درجة مئوية.

عندما تكون جاهزة لتحليل HPLC، قم بإعادة تعليق العينة في 300 ميكرولترات من الماء، واخلط بقوة من خلال الدوامة العالية لمدة 10 ثوانٍ. نقل العينة التي تم إعادة تعليقها إلى فلتر أنبوب الطرد المركزي، والطرد المركزي بمعدل 5000 مرة ز لمدة 10 دقائق لإزالة أي متعجل. ثم، نقل العينة التي تمت تصفيتها إلى قارورة زجاجية مناسبة لحقن HPLC.

في هذه الدراسة، يعرض ملف HPLC التمثيلي وقت الاحتفاظ بمعيار CoA-bimane على عمود HPLC C18. تم حقن كميات متزايدة من معيار CoA-bimane بشكل فردي، وتم رسم المناطق الواقعة تحت القمم في الكروماتوغرامات CoA-bimane كدالة لمدخل CoA-bimane. عكس المنحنى القياسي حجم الامتصاص من CoA-bimane في طول موجة من 393 نانومتر.

كما انعكس الفلور من CoA-bimane في الطول الموجي إثارة من 393 نانومتر والطول الموجي للانبعاثات من 470 نانومتر. ويشار إلى فصل HPLC اللاحقة وملامح الكشف النموذجية عن كبد الماوس أو خلايا C3A البشرية المستزرعة هنا من خلال القمم الحمراء ، مع وقت الاحتفاظ بين 11 و 12 دقيقة باستخدام برنامج elution. إذا كان رد الفعل مع mBBr لا تسفر عن نتائج يمكن الكشف عنها، قد تحتاج كمية من Trizma-HCl إلى تعديل لخفض درجة ح H إلى ما يقرب من ثمانية.

من الممكن الكشف عن جزيئات خلوية إضافية تحتوي على sulfhydryl أو ثيوستر مويتيس كمشتقات ثنائية. على سبيل المثال، الجلوتاثيون-bimane يمكن الكشف عن طريقة HPLC. هذه التقنية سوف تسمح للباحثين الآخرين للتحقيق في الدور المحتمل للخلل في التوازن العصبي المرتبطة بالخلل الأيضي، مثل النماذج الحيوانية من مرض السكري من النوع 2.

يجب على الباحثين استخدام معدات الحماية الشخصية عند العمل مع المذيبات العضوية المستخدمة لاستخراج المرحلة الصلبة.