التحليل الخلوي للحمض النووي الثنائي الميكروي والتدفق المضخم للخلايا من Formalin-الثابتة البارافين-جزءا لا يتجزا من الانسجه المولية

الميزة الأساسية لبروتوكول genotyping لدينا هو أنه يقلل من التلوث بالحمض النووي الأمومي، الذي هو التحدي الرئيسي عندما genotyping الأنسجة الولية ثابتة، البارافين جزءا لا يتجزأ من. تدفق cytometry هو طريقة سريعة وغير مكلفة التي تسهل إلى حد كبير تشخيص الشامات hydatidiform. لكل formalin ثابت البارافين جزءا لا يتجزأ، أو FFPE، المنتج من الحمل، وإعداد أربعة ميكرون سميكة الهماتوسلين واليوسين وصمة عار القسم كما هو مفصل في هذا الفيديو للتقييم المورفولوجية عن طريق المجهر.

ضع كتل FFPE على الجليد لمدة 15 دقيقة لتسهيل عملية القطاعات. ضبط microtome لقطع المقاطع التي هي أربعة ميكرون سميكة للتقييم المورفولوجي المجهري. وضع كتلة الباردة في microtome وقطع قسم واحد من كل كتلة لH & E تلطيخ.

باستخدام ملقط، نقل كل قسم إلى حمام الماء 45 درجة مئوية. التقط القسم من حمام الماء مع شريحة مشحونة بشكل إيجابي سبق تسميتها برقم تعريف العينة باستخدام قلم رصاص. ضع الشرائح التي تحتوي على المقاطع في فرن عند درجة حرارة 65 درجة مئوية للسماح للأبواب بالتمسك بالشرائح.

تبقى الشرائح في الفرن لمدة 25 دقيقة. تنفيذ تلطيخ H & E عن طريق غمر الشرائح في الجرار تلطيخ المناسبة للفترة الزمنية الصحيحة كما جدولة في بروتوكول النص. قم بتركيب الأجزاء ذات الميكرنات الأربعة للتحليل المورفولوجي مع وسيط التركيب.

وتغطي مع زلات الغطاء الزجاجي. باستخدام الشرائح H & E والمجهر الخفيف، حدد كتلة FFPE التي لديها أكبر كمية من الزغب chorionic. وإذا كان ذلك ممكنا، كتلة التي لديها الزغب المشيمي منفصلة عن وليس تختلط مع أنسجة الأم.

ضبط microtome لقطع المقاطع التي هي 10 ميكرون سميكة لاستخراج الحمض النووي. قطع 10 إلى 30 أقسام، اعتمادا على كمية من الزغب chorionic في الكتلة. بعد التقاط المقاطع مع الشرائح كما كان من قبل، ضع الشرائح التي تحتوي على أقسام في فرن في 65 درجة مئوية للسماح المقاطع إلى الالتزام الشرائح.

تبقى الشرائح في الفرن لمدة 20 دقيقة. تنفيذ تلطيخ H & E عن طريق غمر الشرائح في الجرار تلطيخ المناسبة للفترة الزمنية الصحيحة كما جدولة في بروتوكول النص. اترك الشرائح تحت غطاء الدخان لمدة لا تقل عن ثلاث ساعات حتى تتبدد روائح الزيلين السامة.

باستخدام ملقط، المسيل للدموع قطعة صغيرة من الورق من مسح الورق مبللة. تحت مجهر ستيريو خفيف، استخدم ملقط وقطع صغيرة من مناديل الورق المبللة بالماء لتكشط جميع أنسجة الأمومة غير المرغوب فيها من بقع H&E 10 ميكرون سميكة. مفتاح هذه الخطوة هو الصبر، وخاصة بالنسبة للكم الكتل الصعبة.

من المهم أيضا أن يكون شخص آخر نلقي نظرة لضمان عدم وجود أنسجة الأمومة غاب. الآن، المسيل للدموع قطعة جديدة من الورق من مناديل الورق مبللة واستخدامها لجمع الزغب chorionic. ضع قطع مناديل الورق مع الزغب الترمي المرفقة في أنبوب 1.5 مل المسمى.

تقليل كمية من مناديل الورق المستخدمة في هذه الخطوة كما أن الكثير قد تسد العمود استخراج الحمض النووي وبالتالي تقليل الكمية النهائية من الحمض النووي التي تم جمعها. اتبع بروتوكول استخراج الحمض النووي من عدة FFPE لإجراء استخراج الحمض النووي. باستخدام مطياف المختبر، تحميل 1 ميكرولتر من الحمض النووي وقياس الامتصاص في 216 نانومتر من أجل القياس الكمي.

تحميل 1 ميكرولتر من الحمض النووي على جل agarose 2٪ وتشغيل جل الكهرباء في الجهد من 80 إلى 100 فولت للتقييم النوعي. استناداً إلى نتائج تقييم الحمض النووي، اختر حجم الحمض النووي لاستخدامها في التضخيم تكرار PCR قصير الترادف متعدد. تهدف إلى استخدام الحد الأدنى من 1000 نانوغرام من الحمض النووي.

انتقل إلى تضخيم PCR، والكهرباء الشعرية، وتحليل البيانات كما هو موضح في بروتوكول النص. لاختيار كتلة FFPE المثالي، استخدم شرائح H & E على مجهر خفيف لتحديد كتلة FFPE التي لديها حوالي 50 إلى 70٪ من أنسجة تتألف من الزغب المشيمي. بالنسبة للكميات التي لا تحتوي على الكمية المثالية من الزغب المشيمي ، قم بإثراء الزغب المشيمي أثناء تنفيذ القسم.

للقيام بذلك، تحديد أي جانب من أقسام قطع الطازجة يحتوي على أكثر من الزغب chorionic وفقا لH & E الشريحة المقابلة. ثم، استخدم شفرة لقطع النصف الآخر الذي يحتاج إلى التخلص منه من أجل إثراء الزغب المشيمي. لأداء قسم من كتلة أفضل FFPE ممكن، وقطع أربعة أقسام التي هي 50 ميكرون سميكة باستخدام microtome.

في حالة عدم توفر كتلة FFPE مثالية ، تهدف إلى الحفاظ على نسبة الزغب المشيمي إلى أنسجة الأم مع ذلك. على سبيل المثال، إذا كانت 30٪ فقط من الكتلة تتكون من الزغب المشيمي، في حين أن البقية لديها أنسجة الأمومة، ثم إزالة ما لا يقل عن نصف القسم الذي يحتوي على أنسجة الأمهات، واستخدام المزيد من المقاطع للتعويض. ضع الأقسام في أنابيب 15 مل المسمى.

من أجل إزالة الاحتياف وإعادة الإماهة، اعمل في غطاء أبخرة لإضافة كل كاشف وانتظر الفترة الزمنية المناسبة كما تم جدولته في بروتوكول النص. ثم، إزالة الكاشف عن طريق شفط فراغ مع ماصة باستور. المقبل، إضافة أربع درجات مئوية حل سيترات لأنابيب 15 مل.

بعد وضع في حمام الماء 80 درجة مئوية لمدة ساعتين، والسماح للمحلول تبرد إلى درجة حرارة الغرفة. إزالة حل سيترات عن طريق شفط الفراغ. إضافة ستة ملليلتر من 1x PBS، دوامة، وانتظر من دقيقة إلى دقيقتين للسماح للأنسجة لتسوية إلى أسفل.

إذا لزم الأمر، الطرد المركزي العينات في 1000 دورة في الدقيقة لمدة 30 ثانية. إزالة 1X PBS عن طريق شفط فراغ. الآن إضافة مل واحد من محلول البيبسين المُحمّى مسبقاً، ثم ضعه في حمام جاف 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.

دوامة كل 10 دقائق. إعداد مادة اليوديد الريبوينوتشيم A حل في آخر 10 دقائق من هذا الحضانة. إضافة آخر ستة مل من 1X PBS، دوامة، وانتظر من دقيقة إلى دقيقتين للسماح للأنسجة لتسوية إلى أسفل.

مرة أخرى ، وإزالة 1X PBS عن طريق شفط الفراغ. إضافة 550 ميكرولترات من مادة يوديد الريبوينوتشيم A، ووضع العينات في حمام جاف 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. استخدام ملقط لوضع خمسة سم في خمسة سم قطعة من 48 ميكرون شبكة الترشيح في الجزء العلوي من أنابيب البوليسترين أسفل جولة للاستخدام مع تدفق cytometer.

تصفية الحل عن طريق الأنابيب السائل من خلال شبكة وإلى أنبوب. العينات جاهزة الآن ليتم تشغيلها على مقياس التدفق. الاحتفاظ بها ملفوفة في احباط حتى أنها على استعداد ليتم تشغيلها.

وأخيراً، قم بإجراء تحليل تدفق الثغرات والبيانات كما هو موضح في بروتوكول النص. القمر الصناعي المجهري genotyping من الخلد هيداتيفورم جزئي، جنبا إلى جنب مع الحمض النووي للمريض وشريكها، ويكشف أن الخلد المريض هو غير صحيح ثلاثي. أول علامة 1 يظهر اثنين من القمم في نتاج الحمل.

نشأت الذروة الأولى من الأم، لأن الأم وحدها لديها ذروة بهذا الحجم. بعد نفس المنطق، تأتي الذروة الثانية من الأب لأنه يشترك في نفس الغيل. لاحظ كيف أن الذروة الثانية هي أعلى بكثير من الأولى، مشيرا إلى أن هناك على الارجح جرعتين من الأليل الأب نفسه في تلك الذروة.

تلوث الأمهات هو الحد الأدنى جدا في هذا المنتج من الحمل لأنه يعرض ذروة صغيرة جدا في موقف من الأليل الأم الثانية. تُظهر العلامة الثانية ثلاث قمم في ناتج الحمل. اثنين من هذه القمم تنبع من الأب، وواحدة من الأم.

العلامتان الثالثة والرابعة متشابهتان مع العلامة الأولى، وتظهران أيضاً آليلين قادمين من الأب، وواحدة من الأم. منذ جميع علامات الأربعة تظهر باستمرار ثلاثة أليل، اثنان من أصل الأب وواحد من الأم، يمكن للمرء أن يستنتج أن هذا المنتج من الحمل هو غير صادق ثلاثي ويؤكد تشخيص الخلد الجزئي. لتفسير نتائج الـ genotyping، من المهم أن تكون على دراية بمستوى التلوث بناءً على الملاحظات التي تم أخذها أثناء خطوات التنظيف.

وبالنسبة لبعض الحالات، لا يمكننا التوصل إلى استنتاج باتباع هاتين الطريقتين. في مثل هذه الحالات، نستخدم أساليب أخرى مثل FISH، للكشف عن الأنماط الجينية الحقيقية. وقد سمح استخدام السواتل الصغرى الجينية بالتشخيص الدقيق للضاوي ومهد الطريق لفهم أفضل للنمط الجيني المرتبط بالملامح المختلفة للشامات الهيداتية.