كفاءة النسخ التي تسيطر عليها نظام التعبير Plasmid للتحقيق في استقرار نصوص مرنا في الخلايا الظهارية الألفيولار الابتدائية

لذا فإن نموذجنا يسمح بدراسة التشكيل اللاحق للنسخي لنسخة محددة في الخلايا الظهارية السنخية في الثقافة الأولية وظروفها الفسيولوجية والفيزيولوجية. وبالتالي فإن transfection عابرة من الخلايا الظهارية السنخية الأولية لديها تأثير ضئيل على فسيولوجيا الخلية والتمثيل الغذائي، والذي يشكل ميزة واضحة على البروتوكولات الكلاسيكية باستخدام مثبطات النسخ. لتوليد استجابة plasmid التعبير عن جين من الاهتمام ، وتسلسل الجين ، ومواقع استنساخ متعددة من ناقلات غير قابل للاندهار يجب تحليلها لتحديد تسلسل التعرف في مواقع الاستنساخ المتعددة التي لا توجد داخليا في الجين.

باستخدام عالية الدقة طق البوليميراز والمعايير تداخل تقنيات PCR، يحيط جين من الفائدة مع اثنين من مواقع التعرف على إنزيم تقييد مختارة باستخدام التمهيديات مصمم. يجب تضمين تسلسل في ترميز الـ V5 في المنبع من جينة الاهتمام لتمييز التعبير عن الجين المُصاب بالعدوى عن التعبير الداخلي. يمكن توليد المسوخ عن طريق الحذف المتسلسل لدراسة آثار المناطق الثلاث غير المترجمة الرئيسية المختلفة على استقرار مرنا الجينات باستخدام الأحرف التمهيدية العكسية التي تقوم بترميز موقع تعدد الأمهات الذي يحذف تدريجياً النهاية الرئيسية الثلاثة للمنطقة غير المترجمة.

في نهاية المطاف، يمكن تأكيد إدراج جين الفائدة من خلال تحليل القيود. ويمكن تأكيد التوجه الجيني وعدم وجود طفرات يحتمل أن يتم إدخالها أثناء rtPCR عن طريق التسلسل. بالنسبة لtransfection من نوع الرئة الفئران الأولية اثنين من الخلايا الظهارية السنخية، بذور الخلايا في مرة واحدة 10 إلى الخلايا السادسة لكل سنتيمتر مربع في 100 ملليمتر أطباق بيتري في وجود كامل الحد الأدنى من المتوسطة الأساسية.

ثقافة ل 24 ساعات في 37 درجة مئوية في 5٪ ثاني أكسيد الكربون مع الرطوبة. في اليوم التالي، إضافة 500 ميكرولترات من المتوسط الكامل دون مضاد حيوي إلى كل بئر من لوحة جديدة 12 جيدا وقبل الدافئة لوحة في 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. خلال هذا الحضانة، إضافة ميكروغرام واحد من بلازميد استجابة وميكر واحد من ناقلات التنظيمية إلى أنبوب واحد 1.5 ملليلتر في البئر.

اغسل الخلايا الظهارية السنخية بـ 10 ملليلترات في البئر من 37 درجة مئوية PBS بدون الكالسيوم أو المغنيسيوم وتعامل الخلايا بخمس ملليلترات في البئر من 37 درجة مئوية 0.05٪ التربسين لمدة 2-4 دقائق في حاضنة ثقافة الخلية. عندما تكون الخلايا قد فصلت، تحييد التربسين مع 10 ملليلتر في بئر من المتوسط الكامل دون مضاد حيوي وجمع الخلايا في أنبوب جديد 50 ملليلتر. غسل الطبق مع أربعة ملليلتر من المتوسطة الطازجة لجمع أي الخلايا المتبقية ورواسب الخلايا عن طريق الطرد المركزي.

إعادة تعليق بيليه في ملليلتر واحد من برنامج تلفزيوني لحساب والطرد المركزي الخلايا مرة أخرى. Resuspend بيليه في كثافة أربعة أضعاف 10 إلى الخلايا السابعة لكل ملليلتر من العازلة resuspension وإضافة أربع مرات 10 إلى الخلايا الخامسة إلى كل أنبوب من البلازميد والمتجه مع خلط لطيف. ضع أنبوبًا واحدًا في جهاز الكهربة وملأ الأنبوب بـ 3.5 ملليلتر من العازلة الكهالكية.

اجبس المكبس تمامًا لإدراج طرف قطب مطلي بالذهب في ماصة ويخلط محتويات الأنبوب بلطف. استلهم الخلايا بعناية باستخدام ماصة وأدخل الماصات في محطة الكهرباء حتى يتم سماع صوت النقر. حدد بروتوكول الإلكتروبور المناسب للخلايا الظهارية السنخية واضغط على Start على شاشة اللمس.

مباشرة بعد transfection، وإزالة ماصة ونقل الخلايا في بئر واحد من قبل 12 لوحة جيدا. عندما تكون جميع الخلايا الكهربية ومطلية ، ضع اللوحة في حاضنة ثقافة الخلية ، واستبدال المافق في كل بئر بوسيلة كاملة بالمضادات الحيوية بعد يومين. ويمكن تأكيد نجاح transfection من خلال التعبير عن EGFP كما لوحظ من قبل المجهر الفلوريسنس أو تدفق قياس الاستئصال باستخدام ناقل مكافحة.

لمنع النسخ الجينية من الفائدة، 72 ساعة بعد transfection استبدال نابيرت مع مليلتر واحد في بئر من المتوسط الكامل تكمل مع ميكروغرام واحد لكل ملليلتر من adoxycycline الطازجة. لتقييم نصف عمر مرنا من الجين من الفائدة، والعودة لوحة إلى حاضنة ثقافة الخلية من 15 دقيقة إلى ست ساعات. غسل واحد جيدا مع ملليلتر واحد من الجليد البارد PBS قبل lysing الخلايا مع 500 microliters من عازلة تحلل من طقم استخراج الكلوروفورم الكلوروفورم الفينول المتاحة تجاريا واهتزاز لطيف في كل نقطة زمنية تجريبية.

ثم، عزل الجيش الملكي النيبالي وفقا لتعليمات عدة وتحديد العائد RNA والنقاء بواسطة القياس الطيفي في 230، 260، و 280 نانومتر. لتحديد استقرار الحمض النووي الريبي المعزول، أول علاج ميكروغرام واحد من مجموع الحمض النووي الريبي من كل عينة مع RNase مجاناً DNase واحدة لإزالة أي آثار الحمض النووي plasmid. استخدام طقم التوليف cDNA المتاحة تجاريا مع مزيج من oligo dT والاعتياءات سداسية عشوائية لتحسين كفاءة النسخ العكسي لعكس نسخ الحمض النووي المستنفدة RNA مجموع في cDNA وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.

إضافة 180 ميكرولترات من المياه الصف البيولوجيا الجزيئية إلى 20 ميكرولترات من مزيج التفاعل لتخفيف رد فعل cDNA في خمسة نانوغرام لكل تركيز ميكرولتر وتمييع على الفور مزيج cDNA مع الأحياء الجزيئية العذبة الصف المياه للوصول إلى 1.25 نانوغرام لكل تركيز ميكرولتر. الجمع بين خمسة microliters من الانترنت الأخضر ماجستير مزيج مع 0.1 ميكرولتر من المياه الصف البيولوجيا الجزيئية، 0.45 ميكرولترات من 7.5 micromolar إلى الأمام التمهيدي، 0.45 ميكرولترات من 7.5 micromolar عكس التمهيدي، وأربعة ميكرولترات من 1.25 نانوغرام لكل ميكروليلتر من cDNA للحصول على حجم رد فعل إجمالي من 10 ميكرولتر. ضع العينات في ثيرسيكلر qPCR وتضخيم جين علامة V5 من الفائدة وtetrocycline transactivator upactivons باستخدام شروط qPCR كما هو مبين وتوليد منحنى ذوبان عالية الدقة لتقييم درجات حرارة ذوبان محددة من amplicons المطلوبة وضمان عدم وجود قمم اكبريكون الضوضاء.

هذه التقنية electroporation الماصات يسهل 25 إلى 30٪ معدل كفاءة transfection كما لوحظ من قبل نسب من الخلايا EGFP الكشف عن طريق المجهر الفلوريسنس والتدفق استئصال الخلايا. علاج الخلايا الظهارية السنخية مع ميكروغرام واحد لكل ملليلتر من الدوكسيسيكلين ليس له تأثير كبير على التعبير عن الحمض الداخلي ألفا ENaC مرنا في أي وقت خلال فترة العلاج. باستخدام نظام التعبير المتحكم به بشكل نسخي كما هو موضح، V5 ألفا ENaC إشارة يمكن تطبيع وفقا لاتتراسيكلين transactivator إشارة متقدمة لتحديد كفاءة transfection باستخدام طريقة دورة القياس الكمي دلتا مزدوجة.

نصف عمر ألفا ENaC مرنا أقصر سبع مرات في وجود نظام التتراسيكلين قبالة مما كانت عليه في وجود actinomycin D, مؤكدا أن actinomycin D يؤدي إلى تحقيق الاستقرار في الرنا ألفا أثرية. وعلاوة على ذلك، cyclohexamide والورم معامل ألفا عامل انخفض بشكل ملحوظ في استقرار النص في حين lipopolysaccharides لا. يمكن إحداث تغييرات كبيرة في تعديل V5 ألفا ENaC استقرار مرنا اعتمادا على المناطق المحذوفة وشملت من ثلاثة الرئيسي المنطقة غير مترجمة.

وبالإضافة إلى ذلك، فإن أكثر من التعبير عن بروتينات ملزمة RNA محددة يقلل من استقرار 5-ألفا ENaC مرنا مقارنة مع transfection مع pcdna فارغة ثلاثة plasmid. هذه الأداة ستكون مفيدة للاستعلام عن رؤى جديدة في التنظيم ما بعد النسخ من الجينات الرئيسية المعنية في وظيفة ظهارة السنخية وظروفهم الفسيولوجية أو المرضية.