كفاءة النسخ التي تسيطر عليها نظام التعبير Plasmid للتحقيق في استقرار نصوص مرنا في الخلايا الظهارية الألفيولار الابتدائية
March 6th, 2020
هنا ، نقدم أداة يمكن استخدامها لدراسة التشكيل ما بعد النسخ من نسخة في الخلايا الظهارية السنخية الأولية باستخدام نظام تعبير غير قابل للاختزال إلى جانب تقنية الكهربية ماصة.
لذا فإن نموذجنا يسمح بدراسة التشكيل اللاحق للنسخي لنسخة محددة في الخلايا الظهارية السنخية في الثقافة الأولية وظروفها الفسيولوجية والفيزيولوجية. وبالتالي فإن transfection عابرة من الخلايا الظهارية السنخية الأولية لديها تأثير ضئيل على فسيولوجيا الخلية والتمثيل الغذائي، والذي يشكل ميزة واضحة على البروتوكولات الكلاسيكية باستخدام مثبطات النسخ. لتوليد استجابة plasmid التعبير عن جين من الاهتمام ، وتسلسل الجين ، ومواقع استنساخ متعددة من ناقلات غير قابل للاندهار يجب تحليلها لتحديد تسلسل التعرف في مواقع الاستنساخ المتعددة التي لا توجد داخليا في الجين.
باستخدام عالية الدقة طق البوليميراز والمعايير تداخل تقنيات PCR، يحيط جين من الفائدة مع اثنين من مواقع التعرف على إنزيم تقييد مختارة باستخدام التمهيديات مصمم. يجب تضمين تسلسل في ترميز الـ V5 في المنبع من جينة الاهتمام لتمييز التعبير عن الجين المُصاب بالعدوى عن التعبير الداخلي. يمكن توليد المسوخ عن طريق الحذف المتسلسل لدراسة آثار المناطق الثلاث غير المترجمة الرئيسية المختلفة على استقرار مرنا الجينات باستخدام الأحرف التمهيدية العكسية التي تقوم بترميز موقع تعدد الأمهات الذي يحذف تدريجياً النهاية الرئيسية الثلاثة للمنطقة غير المترجمة.
في نهاية المطاف، يمكن تأكيد إدراج جين الفائدة من خلال تحليل القيود. ويمكن تأكيد التوجه الجيني وعدم وجود طفرات يحتمل أن يتم إدخالها أثناء rtPCR عن طريق التسلسل. بالنسبة لtransfection من نوع الرئة الفئران الأولية اثنين من الخلايا الظهارية السنخية، بذور الخلايا في مرة واحدة 10 إلى الخلايا السادسة لكل سنتيمتر مربع في 100 ملليمتر أطباق بيتري في وجود كامل الحد الأدنى من المتوسطة الأساسية.
ثقافة ل 24 ساعات في 37 درجة مئوية في 5٪ ثاني أكسيد الكربون مع الرطوبة. في اليوم التالي، إضافة 500 ميكرولترات من المتوسط الكامل دون مضاد حيوي إلى كل بئر من لوحة جديدة 12 جيدا وقبل الدافئة لوحة في 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. خلال هذا الحضانة، إضافة ميكروغرام واحد من بلازميد استجابة وميكر واحد من ناقلات التنظيمية إلى أنبوب واحد 1.5 ملليلتر في البئر.
اغسل الخلايا الظهارية السنخية بـ 10 ملليلترات في البئر من 37 درجة مئوية PBS بدون الكالسيوم أو المغنيسيوم وتعامل الخلايا بخمس ملليلترات في البئر من 37 درجة مئوية 0.05٪ التربسين لمدة 2-4 دقائق في حاضنة ثقافة الخلية. عندما تكون الخلايا قد فصلت، تحييد التربسين مع 10 ملليلتر في بئر من المتوسط الكامل دون مضاد حيوي وجمع الخلايا في أنبوب جديد 50 ملليلتر. غسل الطبق مع أربعة ملليلتر من المتوسطة الطازجة لجمع أي الخلايا المتبقية ورواسب الخلايا عن طريق الطرد المركزي.
إعادة تعليق بيليه في ملليلتر واحد من برنامج تلفزيوني لحساب والطرد المركزي الخلايا مرة أخرى. Resuspend بيليه في كثافة أربعة أضعاف 10 إلى الخلايا السابعة لكل ملليلتر من العازلة resuspension وإضافة أربع مرات 10 إلى الخلايا الخامسة إلى كل أنبوب من البلازميد والمتجه مع خلط لطيف. ضع أنبوبًا واحدًا في جهاز الكهربة وملأ الأنبوب بـ 3.5 ملليلتر من العازلة الكهالكية.
اجبس المكبس تمامًا لإدراج طرف قطب مطلي بالذهب في ماصة ويخلط محتويات الأنبوب بلطف. استلهم الخلايا بعناية باستخدام ماصة وأدخل الماصات في محطة الكهرباء حتى يتم سماع صوت النقر. حدد بروتوكول الإلكتروبور المناسب للخلايا الظهارية السنخية واضغط على Start على شاشة اللمس.
مباشرة بعد transfection، وإزالة ماصة ونقل الخلايا في بئر واحد من قبل 12 لوحة جيدا. عندما تكون جميع الخلايا الكهربية ومطلية ، ضع اللوحة في حاضنة ثقافة الخلية ، واستبدال المافق في كل بئر بوسيلة كاملة بالمضادات الحيوية بعد يومين. ويمكن تأكيد نجاح transfection من خلال التعبير عن EGFP كما لوحظ من قبل المجهر الفلوريسنس أو تدفق قياس الاستئصال باستخدام ناقل مكافحة.
لمنع النسخ الجينية من الفائدة، 72 ساعة بعد transfection استبدال نابيرت مع مليلتر واحد في بئر من المتوسط الكامل تكمل مع ميكروغرام واحد لكل ملليلتر من adoxycycline الطازجة. لتقييم نصف عمر مرنا من الجين من الفائدة، والعودة لوحة إلى حاضنة ثقافة الخلية من 15 دقيقة إلى ست ساعات. غسل واحد جيدا مع ملليلتر واحد من الجليد البارد PBS قبل lysing الخلايا مع 500 microliters من عازلة تحلل من طقم استخراج الكلوروفورم الكلوروفورم الفينول المتاحة تجاريا واهتزاز لطيف في كل نقطة زمنية تجريبية.
ثم، عزل الجيش الملكي النيبالي وفقا لتعليمات عدة وتحديد العائد RNA والنقاء بواسطة القياس الطيفي في 230، 260، و 280 نانومتر. لتحديد استقرار الحمض النووي الريبي المعزول، أول علاج ميكروغرام واحد من مجموع الحمض النووي الريبي من كل عينة مع RNase مجاناً DNase واحدة لإزالة أي آثار الحمض النووي plasmid. استخدام طقم التوليف cDNA المتاحة تجاريا مع مزيج من oligo dT والاعتياءات سداسية عشوائية لتحسين كفاءة النسخ العكسي لعكس نسخ الحمض النووي المستنفدة RNA مجموع في cDNA وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
إضافة 180 ميكرولترات من المياه الصف البيولوجيا الجزيئية إلى 20 ميكرولترات من مزيج التفاعل لتخفيف رد فعل cDNA في خمسة نانوغرام لكل تركيز ميكرولتر وتمييع على الفور مزيج cDNA مع الأحياء الجزيئية العذبة الصف المياه للوصول إلى 1.25 نانوغرام لكل تركيز ميكرولتر. الجمع بين خمسة microliters من الانترنت الأخضر ماجستير مزيج مع 0.1 ميكرولتر من المياه الصف البيولوجيا الجزيئية، 0.45 ميكرولترات من 7.5 micromolar إلى الأمام التمهيدي، 0.45 ميكرولترات من 7.5 micromolar عكس التمهيدي، وأربعة ميكرولترات من 1.25 نانوغرام لكل ميكروليلتر من cDNA للحصول على حجم رد فعل إجمالي من 10 ميكرولتر. ضع العينات في ثيرسيكلر qPCR وتضخيم جين علامة V5 من الفائدة وtetrocycline transactivator upactivons باستخدام شروط qPCR كما هو مبين وتوليد منحنى ذوبان عالية الدقة لتقييم درجات حرارة ذوبان محددة من amplicons المطلوبة وضمان عدم وجود قمم اكبريكون الضوضاء.
هذه التقنية electroporation الماصات يسهل 25 إلى 30٪ معدل كفاءة transfection كما لوحظ من قبل نسب من الخلايا EGFP الكشف عن طريق المجهر الفلوريسنس والتدفق استئصال الخلايا. علاج الخلايا الظهارية السنخية مع ميكروغرام واحد لكل ملليلتر من الدوكسيسيكلين ليس له تأثير كبير على التعبير عن الحمض الداخلي ألفا ENaC مرنا في أي وقت خلال فترة العلاج. باستخدام نظام التعبير المتحكم به بشكل نسخي كما هو موضح، V5 ألفا ENaC إشارة يمكن تطبيع وفقا لاتتراسيكلين transactivator إشارة متقدمة لتحديد كفاءة transfection باستخدام طريقة دورة القياس الكمي دلتا مزدوجة.
نصف عمر ألفا ENaC مرنا أقصر سبع مرات في وجود نظام التتراسيكلين قبالة مما كانت عليه في وجود actinomycin D, مؤكدا أن actinomycin D يؤدي إلى تحقيق الاستقرار في الرنا ألفا أثرية. وعلاوة على ذلك، cyclohexamide والورم معامل ألفا عامل انخفض بشكل ملحوظ في استقرار النص في حين lipopolysaccharides لا. يمكن إحداث تغييرات كبيرة في تعديل V5 ألفا ENaC استقرار مرنا اعتمادا على المناطق المحذوفة وشملت من ثلاثة الرئيسي المنطقة غير مترجمة.
وبالإضافة إلى ذلك، فإن أكثر من التعبير عن بروتينات ملزمة RNA محددة يقلل من استقرار 5-ألفا ENaC مرنا مقارنة مع transfection مع pcdna فارغة ثلاثة plasmid. هذه الأداة ستكون مفيدة للاستعلام عن رؤى جديدة في التنظيم ما بعد النسخ من الجينات الرئيسية المعنية في وظيفة ظهارة السنخية وظروفهم الفسيولوجية أو المرضية.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
نظرة عامة
تقدم هذه المقالة أداة جديدة لدراسة التعديل اللاحق للنسخ في الخلايا الظهارية السنخية الأولية. تستخدم الطريقة نظام تعبير محفزًا مقترنًا بتقنية الكهرباء المحقنة، مما يسمح باضطراب أدنى لفيزيولوجيا الخلية.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلم
- علم الأعصاب
- بيولوجيا الخلية
- التعبير الجيني
الخلفية
- التعديل اللاحق للنسخ ضروري لفهم تنظيم الجينات.
- الخلايا الظهارية السنخية الأولية مهمة لدراسة فيزيولوجيا الرئة.
- الطرق التقليدية غالبًا ما تعطل الوظائف الخلوية.
- تهدف هذه الدراسة إلى توفير نهج أكثر فعالية للنقل المؤقت.
غرض الدراسة
- لتطوير أداة لدراسة تعديل نسخ معينة.
- لتقليل تأثير النقل على فيزيولوجيا الخلية.
- لتحليل تأثيرات ثلاثة مناطق غير مترجمة في النهاية الثلاثية على استقرار الرنا المرسال.
الطرق المستخدمة
- نظام تعبير محفز لجين المهتم.
- تقنية الكهرباء المحقنة بالمحقنة لنقل الخلايا.
- تفاعل البوليميراز المتسلسل المتداخل لتوليد البلازميدات المجيب.
- الحذف التسلسلي للمناطق غير المترجمة لدراسة استقرار الرنا المرسال.
النتائج الرئيسية
- نجاح النقل المؤقت مع الحد الأدنى من الاضطراب الفسيولوجي.
- تحديد مواقع التعرف المثلى على إنزيمات التقييد.
- توليد طفرات لدراسة التأثيرات على استقرار الرنا المرسال.
- ثبتت فائدة الأداة في السياقات الفسيولوجية والمرضية.
الخلاصات
- تعزز الأداة المطورة دراسة التعبير الجيني في الخلايا الظهارية السنخية.
- تقدم مزايا على الطرق التقليدية من خلال الحفاظ على وظيفة الخلية.
- يمكن لهذا النهج تسهيل مزيد من البحث في بيولوجيا الرئة.
الأسئلة الشائعة
Executive Industry Relevance
This method enables precise measurement of mRNA stability in primary alveolar epithelial cells under physiological and pathophysiological conditions without disrupting cell homeostasis. By using a transcriptionally controlled plasmid expression system with inducible promoters and epitope tagging, researchers can isolate posttranscriptional effects from transcriptional artifacts. The approach supports target validation and mechanistic de-risking in pulmonary disease research by providing quantitative, reproducible data on transcript half-life modulation.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by measuring mRNA stability changes linked to UTR modifications or RNA-binding protein overexpression.
- Operational Value: Uses epitope-tagged constructs (V5) to distinguish transfected from endogenous transcripts, reducing assay interference.
- Predictive Value: Supports predictive confidence in target selection by linking 3'UTR regions to mRNA stability under disease-relevant stimuli like TNF-α or LPS.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Generates quantitative Cq-derived data suitable for normalization and half-life calculation via the double delta quantification cycle method.
- Reproducibility: Pipette electroporation achieves 25-30% transfection efficiency in primary cells with minimal impact on endogenous gene expression (e.g., alpha ENaC).
- Scalability: Compatible with qPCR and high-resolution melting curve analysis for specific amplicon detection and noise exclusion.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Models pathophysiological conditions (e.g., inflammation via TNF-α, infection via LPS) to assess mRNA stability changes in alveolar epithelium.
- Translational Continuity: Links UTR deletions to altered mRNA half-life, providing a mechanism-based biomarker for posttranscriptional dysregulation.
- Risk-Adjusted Advancement: Identifies conditions that destabilize transcripts (e.g., cycloheximide, TNF-α) versus stabilizers (actinomycin D artifacts), informing lead optimization.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target validation through lead identification, offering a functional readout for posttranscriptional regulation that complements transcriptional and translational assays.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on mRNA stability by isolating posttranscriptional modulation using inducible expression and transcriptional arrest (doxycycline).
- Screening: Enables assay standardization through inducible systems that avoid global transcriptional inhibitors, preserving cellular physiology during compound screening.
- Analytics: Generates quantitative mRNA measurements over time via qPCR of epitope-tagged transcripts, enabling half-life derivation and condition comparison.
- Translational Research: Connects molecular findings (UTR stability, RBP effects) to alveolar epithelial function in lung physiology and disease models.
- Enterprise Reuse: The plasmid design and electroporation protocol can be adapted to other genes of interest, supporting platform reuse across pulmonary target programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity in posttranscriptional regulation by distinguishing transfected mRNA stability from endogenous noise.
- Operational Value: Minimizes cellular disruption compared to actinomycin D, which artifactually stabilizes transcripts, improving data fidelity.
- Strategic Value: Enables better go/no-go decisions by revealing UTR- or RBP-mediated instability that could affect target durability in vivo.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of targets based on mRNA stability profiles under pathophysiological stress.
Implementation Considerations
- Requires molecular cloning expertise to flank genes with restriction sites and insert V5 epitope tags via overlap PCR.
- Depends on electroporation equipment and optimization for primary alveolar epithelial cells to achieve viable transfection efficiency.
- Necessitates qPCR infrastructure with SYBR Green detection and melting curve analysis for specific amplicon validation.
- Involves RNA isolation, DNase treatment, and cDNA synthesis steps compatible with low-input samples from primary cells.
- Limited by the need to validate that inducible systems do not alter endogenous gene expression (e.g., alpha ENaC) during doxycycline treatment.
