القياس الكمي لمقاومه المضادات الحيوية بوساطة البلازما في نهج التطور التجريبي

Plasmids هي عناصر خارج كروموسومية موجودة في كل مكان في معظم الأنواع البكتيرية والموائل حيث أنها عوامل مهمة جدا لنقل الجينات الجانبي لأنها يمكن أن تهاجر بين الخلايا وبين السكان. ومن أبرز الأمثلة على هذا النقل نشر جينات مقاومة المضادات الحيوية التي يتم ترميزها على البلازميدات. لبناء نموذج plasmid أن ترميز جين مقاومة المضادات الحيوية، واختيار العمود الفقري البلازميد وPCR تضخيم العمود الفقري باستخدام البوليميراز عالية الدقة والناميكرات التي تربط على قالب البلازميد. في حالتنا استخدمنا العمود الفقري pBBR1 plasmid. المقبل، تضخيم المقاومة جين nptII بما في ذلك المروج TN5 الأصلي باستخدام البوليميراز عالية الدقة. تصميم التمهيديات للجين المقاومة مع ما يقرب من 20 أزواج قاعدة من التكامل تسلسل إلى العمود الفقري البلازميد. بعد PCRs، ودمج منطقة homology من المنتج PCR الجينات المقاومة لتنقية إلى العمود الفقري البلازميد النقي باستخدام الجمعية متساوي الحرارة في 50 درجة لمدة 60 دقيقة. تحويل المنتج المندمج إلى E.Coli DH5-ألفا باستخدام الكهرباء. لوحة 100 ميكرولتر من الخليط على وسائل الإعلام الانتقائية واحتضان في 37 درجة لحوالي 24 ساعة. ويمكن بعد ذلك استخراج البلازميد والتحقق من صحتها وتحويلها إلى سلالة من النوع البري E.coli MG1655. هذا الغلة سلالة MG1655 pCON.During التعرض للمضادات الحيوية، والبكتيريا تحتاج البلازميد البقاء على قيد الحياة. وهكذا ، فإن البلازميد هو في إطار اختيار إيجابي. في ظل ظروف غير انتقائية ، لذلك بدون المضادات الحيوية ، يتم التخلص من البلازميد إلى الخلية. وكان الهدف من دراستنا لمتابعة البلازميدات في ظل هذه الظروف غير انتقائية مع مرور الوقت. لهذا الغرض، قمنا بتجهيز البلازميدات الصغيرة بجين مقاومة للمضادات الحيوية وأدخلناه إلى الإشريكية القولونية. أجرينا تجربة تطورية ورصدنا تردد البلازميدات عبر طلاء النسخة المتماثلة. يتم الآن إدخال بلازميد تحمل سلالة mg1655 pCON إلى تجربة تطور. أولا، لوحة mg1655 pCON على LB agar لوحات تكملها المضادات الحيوية واحتضان بين عشية وضحاها في 37 درجة. من هذه اللوحة اختيار عشوائي 8 مستعمرات سلف واحتضان بين عشية وضحاها في 37 درجة مع اهتزاز مستمر. في اليوم التالي، يتم نقل السكان إلى التجربة التي أجريت في 96 لوحة بئر عميق. من المهم جداً توزيع النسخ المتماثلة بشكل عشوائي عبر اللوحة. على سبيل المثال، في نهج لوحة الداما. في تجربتنا يتم تخفيف الثقافات ونقلها مع معدلات تخفيف مختلفة وفي اثنين من درجات الحرارة. خلال كل حدث نقل يتم تطبيق علاج التخفيف ويتم تكرار النقل التسلسلي خلال ما مجموعه 98 نقل. على طول التطور التجربة يقدر تردد البلازميدات في عدد السكان من نسبة البلازميد تحمل الخلايا. وقد شاع الطلاء النسخة المتماثلة من قبل استير وجوشوا ليدربرغ في 1950s حيث استخدموه من أجل دراسة مقاومة المخدرات في البكتيريا. وهذه الطريقة تمكنهم من تحسين المسح الضوئي للنمط الظاهري وكشفت في نهاية الدراسة أن مقاومة البنسلين يمكن أن تنشأ في البكتيريا بسبب الطفرات العفوية في الجينوم. لتحديد تردد البلازميد في السكان خلال التجربة ، يتم تخفيف الثقافات الثابتة بشكل متسلسل ومطلية على لوحات LB agar غير انتقائية. ضبط التخفيف وفقا لغلة من 250 إلى 500 مستعمرات في لوحة. يتم احتضان السكان مطلي للنمو بين عشية وضحاها في 37 درجة لأقل من 24 ساعة. المستعمرات هي أفضل تكرار عندما تكون لا تزال صغيرة. بعد نمو بين عشية وضحاها عد جميع المستعمرات باستخدام عداد مستعمرة الآلي من اختيار القارئ. هذا يعطي ال بكتريا إجماليّة حجم مجموعة في الثقافات. لاحظ أنه يجب أن تترك المستعمرات على حافة لوحة خارج. لتكرار الأطباق ، تحتاج إلى لوحات agar انتقائية تكملها المضادات الحيوية ، وكتلة مستديرة ، وحلقة معدنية تناسب الكتلة ، والقماش المخملي العقيم. القماش يحتاج إلى أن يكون 100٪ القطن كما يمكن تعقيم هذا بواسطة autoclavation. ضع القماش على الكتلة واصلحه مع الحلقة المعدنية.ضع الطبق بعناية مع المستعمرات التي تم عدها على سطح القماش المخملي الثابت. انقر على اللوحة في حركات الدائرة بحيث يلمس سطح اللوحة القماش. من المهم جدا أن تلمس جميع المستعمرات المخمل. إزالة لوحة LB ووضع لوحة انتقائية على المخمل. كرر التنصت الدقيق. من المهم مرة أخرى أن اللوحة تلامس المخمل تماما. بعد ذلك، إزالة لوحة انتقائية. يتم احتضان اللوحات في درجة حرارة الغرفة بين عشية وضحاها. في اليوم التالي، هناك حاجة إلى كل من LB وطبقة المضادات الحيوية للتقييم. ضع اللوحات فوق بعضها البعض وقارن النمو. يمكنك بسهولة بقعة المساحات الخالية من المستعمرة. هذه هي المستعمرات التي لا تقاوم المضادات الحيوية. وهكذا، فقدت هذه المستعمرات البلازميد. في النهاية، حدد عدد المستعمرات المفقودة على طبق المضادات الحيوية. هذا الرقم يعطيك خسارة البلازميد كرر الطلاء النسخة المتماثلة من كافة السكان أثناء تجربة تطور أسبوعيا. يمكن أن يكون سبب فقدان بلاسميد من قبل التشوهات المتعددة البلازميد. عند العمل على بناء البلازميد يقول للتعبير عن جين معين في المضيف المفضل لديك سلالة السلوك الأصلي من البلازميد في الجسم الحي فيما يتعلق بتأكيد الدولة يمكن أن تتخذ هو عادة ما يتم تجاهلها. ولكن في سياق تطوري، قد يكون لمثل هذا التأكيد على التغييرات أهمية كبيرة جدا. تحليل التأكيدات plasmid يمكن أن يكون مسعى صعبة للغاية. خاصة البلاميد متعددة من الصعب تحليل لأنها لا يمكن تحديدها بشكل صحيح من قبل PCR أو عن طريق التسلسل. على الجانب الآخر، من الصعب تحليل متعددات البلازميد بواسطة الكهرباء هلام بسبب حجمها الكبير المحتمل وحركتها الكهربائية بطيئة. بروتوكولنا يقدم طريقة بسيطة ومباشرة لفحص وتحديد multimers plasmid في أود أن أقول أي إعداد plasmid معين. لجزيئات البلازميد البصرية استخراج البلازميد من 5 مل ثابتة بين عشية وضحاها ثقافة الخلية باستخدام تحلل القلوية. استخراج بلاسميد من البلازميدات نسخة منخفضة غالبا ما يؤدي إلى تلوث مع الحمض النووي الكروموسومات المضيف الذي يحتاج إلى هضم قبل التصور. لإزالة تلوث الحمض النووي الكروموسومات علاج الحمض النووي البلازميد المستخرجة مع بلاسميد آمنة