تحضير العينات البيولوجية للانتواع في درجة حرارة التبريد باستخدام التحليل الطيفي عالي الدقة لامتصاص الأشعة السينية

تم توحيد هذا البروتوكول للعينات الخلوية ، مما يسمح بمقارنة التجارب التي تعمل في مواقع السنكروترون المختلفة. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي سير عمل بسيط ومباشر يسمح بالحفاظ السريع والموثوق به على التكامل الكيميائي للعينة. قد يكافح الأفراد الجدد في هذه التقنية مع تكوير الخلايا المتكررة المجمدة والتحميل السريع للحبيبات الخلوية في ترتيب العينة المبردة.

يعد فك الارتباط الدقيق والسريع للعينات في درجة الحرارة المبردة أمرا بالغ الأهمية. على هذا النحو ، يعد العرض المرئي ضروريا لفهم كيفية أداء التقنية. لإعداد الكريات الخلوية لخط خلايا البروستاتا البشرية وسرطان المبيض لانتواع السيلينيوم ، قم بزرع العدد المناسب من الخلايا من كل خط خلية في ثلاث قوارير T-75 لكل حالة في وسط زراعة الخلايا المناسب في غطاء تدفق صفائحي ووضع القوارير في 37 درجة مئوية و 5٪ حاضنة زراعة خلايا ثاني أكسيد الكربون حتى تكون الخلايا متقاربة بنسبة 80٪.

لتعريض الخلايا السرطانية لعلاج السيلينيوم, أول سونيكات محضر طازج حلول مخزون الجسيمات النانوية في حمام مائي بالموجات فوق الصوتية لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة قبل تخفيف متسلسل محلول الجسيمات النانوية السيلينيوم في وسط زراعة الخلايا الكامل إلى تركيزات العمل المناسبة. في غطاء التدفق الرقائقي ، اغسل الخلايا بلطف مرتين بخمسة ملليلترات من 37 درجة مئوية PBS لكل غسل واستخدم ماصة معقمة 25 ملليلتر لإضافة 15 ملليلتر بعناية من معالجة السيلينيوم ذات الأهمية إلى أسفل القارورة. أغلق الأغطية دون إغلاق القارورة تماما وضع القوارير أفقيا في حاضنة زراعة الخلايا لمدة 24 ساعة.

لتحضير كريات الخلايا بعد غسل وتجديد وسط الزرع، استخدم مكشطة خلية واحدة لكل قارورة لفصل الخلايا بلطف. استخدم الوسط لطرد أي خلايا عالقة بالقارورة في السوبرناتانت وجمع الخلايا المنفصلة عن طريق الطرد المركزي. اغسل الكريات مرتين في خمسة ملليلترات من PBS لكل أنبوب لكل غسل لإزالة جميع الآثار المتبقية من العلاج وإعادة تعليق الخلايا في ملليلتر واحد من PBS.

انقل الخلايا إلى أنبوب بولي بروبيلين سعة 1.5 ملليلتر وجمع الخلايا باستخدام جهاز طرد مركزي آخر. ثم استخدم ماصة سعة 200 ميكرولتر لإزالة كل المادة الفائقة بلطف وإغراق الجزء السفلي من كل أنبوب سعة 1.5 ملليلتر في النيتروجين السائل إلى مستوى حبيبة الخلية. مباشرة بعد التجميد ، انقل الأنابيب إلى ديوار النيتروجين السائل للتخزين على المدى الطويل.

بالنسبة للتحليل الطيفي عالي الدقة لامتصاص الأشعة السينية ، قم بتحسين جميع البلورات من مطياف محلل البلورات في ظروف براغ فيما يتعلق بطاقة خط التألق ذات الأهمية واستخدم مرجعا يعرف عنه موقع الطاقة لحافة الامتصاص بمعايرة طاقة الحزمة أحادية اللون الحادثة. انقل حامل العينة إلى كريوستات الهيليوم السائل للحصول على عينات بيولوجية واضبط الكريستات على 10 درجات كلفن، ثم أغلق الخزانة التجريبية باتباع قواعد سلامة السنكروترون، وابدأ التحليل. هنا ، تظهر أطياف التحليل الطيفي لامتصاص الأشعة السينية عالية الدقة للسيلينيوم في الحالة الأولية وفي الخلايا المحتضنة إلى وسط غذائي أن السيلينيوم في جسيمات السيلينيوم النانوية الأولية كانت موجودة كأشكال صفر السيلينيوم وأشكال تشبه السيلوليت.

بعد التفاعلات مع خلايا PC3 ، ومع ذلك ، كان السيلينيوم موجودا بشكل رئيسي في الخلايا كصفر السيلينيوم ، مما يدل على تغيير أنواع السيلينيوم داخل الخلايا. بالنسبة للحديد، تظهر الأطياف المرجعية للتحليل الطيفي عالي الدقة لامتصاص الأشعة السينية مواقع حافة متميزة اعتمادا على حالة أكسدة الحديد، مع تحول الأنواع المخفضة من الحديد إلى قيم طاقة منخفضة. كان هناك طيفان متتاليان تم جمعهما على نفس موضع حبيبة الدياتوم متشابهان ، مما يشير إلى أن تلف الحزمة كان محدودا بين عمليتي اكتساب عند استخدام كريوستات الهيليوم عند 10 كلفن.

وعلاوة على ذلك، كانت الأطياف من مواقع مختلفة من حبيبات الدياتوم متطابقة، مما يدل على أن حبيبة العينة متجانسة وأنه يمكن حساب متوسط الأطياف للحصول على طيف أفضل لنسبة الإشارة إلى الضوضاء. الخطوات الأكثر أهمية هي إعداد تمدد الجسيمات النانوية ، والتكوير في درجة حرارة التبريد ، وإعداد العينات المرجعية القياسية. ويمكن تطبيق هذا الإجراء على تقنيات تحليلية سائبة أخرى، مثل برنامج المقارنات الدولية - MS أو HCPLC-ICP-MS أو غيرها من التقنيات الطيفية غير السنكروترونية التي يمكن تنفيذها في شكل في درجة حرارة مبردة.

يمكن استكشاف أسئلة علمية أخرى باستخدام هذا الإجراء ، خاصة في مجالات الجيولوجيا الحيوية ، والكيمياء الحيوية ، والعلوم البيئية أو أبحاث السموم. يمكن أن تكون مركبات السيلينيوم وجسيمات السيلينيوم النانوية شاقة لصحتك ويجب التلاعب بها في غطاء كيميائي مخصص باستخدام القفازات والنظارات وقناع الوجه.