رسم خرائط للعلاقات بين الهيكل والوظيفة لعوامل النسخ غير المنضبطة باستخدام التحليل النسخي

الصعب إجراء تحليل دالة الهيكل على عوامل النسخ المتكررة والمضطربة. من خلال اقتران النسخ بالسياق الخلوي الصحيح ، يكشف هذا النهج بشكل أفضل عن علاقات وظيفة البنية المهمة. يسمح استخدام تسلسل الحمض النووي الريبي كناتج وظيفي بالتقييم الفعال لجميع الجينات التي ينظمها بروتين واحد في تجربة واحدة ، مما يجعل الكشف الجزئي عن الوظيفة أكثر احتمالا.

الكشف الجزئي عن الوظيفة مهما بشكل خاص لعوامل نسخ الاندماج الورمي ، لأننا لا نعرف كيف تعمل هذه البروتينات ويمكن أن يؤدي تسلسلها إلى علاجات أفضل في السرطانات التي يحركها الاندماج. على الرغم من أننا سنركز على مجال EWS المضطرب في EWS / FLI ، إلا أن EWS يشارك في عمليات اندماج أخرى تحتوي على مجالات اضطراب ذات وظائف غير محددة بشكل جيد. للحصول على نقل بناء تعبير (كدنا) أولا ، قم بإذابة الفيروس المجمد بسرعة باستخدام تركيبات (كدنا) في حمام مائي بدرجة حرارة 37 درجة مئوية واخلط برفق 2.5 ميكرولتر من ثمانية ملليغرام لكل مليلتر من البوليبرين في كل حقير.

بعد ذلك ، قم بإزالة الوسط من لوحة ثقافة خلية متقاربة بنسبة 50 إلى 70٪ مقاس 10 سم لكل قارورة وتجاوز برفق حجم المليلتر بالكامل من البناء أسفل جانب اللوحة. هز اللوحة لنشر الفيروس بالتساوي عبر الخلايا وضع اللوحة في حاضنة زراعة الأنسجة 37 درجة مئوية لمدة ساعتين ، وهز اللوحة كل 30 دقيقة لمنع جفاف أي مناطق من اللوحة. في نهاية الحضانة ، أضف خمسة ملليلتر من الوسط المكمل بمصل الأبقار الجنينية والمضادات الحيوية وبيروفات الصوديوم والبوليبرين.

بعد الحضانة الليلية في حاضنة زراعة الخلايا ، استبدل المادة الطافية بوسط الاختيار وأعد الخلايا إلى حاضنة زراعة الخلايا لمدة سبعة إلى 10 أيام إضافية للسماح بالاختيار والتعبير عن بناء (كدنا). في نهاية فترة الاختيار ، اجمع الخلايا في أنبوب مخروطي سعة 15 مليلتر للعد وخصص خمسة إلى 10 أضعاف 10 للخلايا الخامسة في أنبوب جديد لتسلسل الحمض النووي الريبي ومرتين 10 للخلايا الست في أنبوب جديد آخر لاستخراج البروتين. قم بترسيب الخلايا عن طريق الطرد المركزي وإعادة تعليق الكريات في مليلتر واحد من PBS البارد أو الطرد المركزي لمدة خمس دقائق.

ثم قم بتجميد كل من الكريات والنيتروجين السائل وتخزين الخلايا عند 80 درجة مئوية تحت الصفر. للتحقق من صحة ضربة قاضية للبروتينات ذات الأهمية والتعبير عن لوحة التركيبات ، قم بمسح عينات محللة البروتين بالأجسام المضادة الأولية والثانوية المناسبة وفقا لبروتوكولات تحليل اللطخة الغربية القياسية. لتقييم جودة الحمض النووي الريبي وكميته ، استخدم المخزن المؤقت للتحلل من مجموعة أدوات الاستخراج القائمة على عمود دوران السيليكا لتجميع عينات خلايا تسلسل الحمض النووي الريبي وتطبيق المحللات على عمود إزالة الحمض النووي الجيني بمعدل أكبر من 13،000 دورة في الدقيقة لمدة 30 إلى 60 ثانية.

بعد ذلك ، تابع تنقية عمود دوران السيليكا واغسل الحمض النووي الريبي على العمود وفقا لتعليمات المجموعة. ثم قم بمسح الحمض النووي الريبي في 30 ميكرولترا من المخزن المؤقت للشطف وقم بتحليل ما لا يقل عن 2.5 ميكروغرام من الحمض النووي الريبي على مقياس الطيف الضوئي بنسبة 260 إلى 280 نانومتر لتقييم كمية الحمض النووي الريبي وجودة العينة. لتحليل ملف fastq ، استخدم Putty لفتح الجهاز لبيئة الحوسبة عالية الأداء وإنشاء دليل تحليل يسمى المشروع.

انتقل إلى المسار إلى دليل المشروع وقم بإنشاء دليل لملفات fastq. gz الأولية المضغوطة تسمى fastq ودليل ثان يسمى trimmed. نحن برنامج نقل الملفات الآمن المناسب لنقل fastq الخام المضغوط.

gz من التخزين المحلي إلى دليل المسار إلى Project FastQ وتحقق من وجود ملف R1 و R2 لكل عينة. انتقل إلى المسار إلى project fastq واستخدم الأمر في trim verore كما هو موضح لقص القراءات منخفضة الجودة من fastq. ملفات GZ.

انتقل إلى المسار إلى دليل المشروع وقم بإنشاء دليل جديد يسمى إخراج STAR. انتقل إلى دليل المسار إلى قطع المشروع واستخدم الأمر كما هو موضح لتشغيل STAR لمحاذاة fastq المقتطع. ملفات GZ.

حدد موقع الإخراج المطلوب للخطوات التالية ، والتي تحتوي على التعداد لكل نسخة في الموقع المشار إليه واستخدم الأمر للقراءة في كل قراءة لكل ملف علامة تبويب إخراج الجينات. بالنسبة للعمود الأول ، استخدم فقط الأحرف التي تسبق الفترة في عمود معرف الجين ENSEMBL لسهولة المعالجة النهائية. ثم استخدم الأمر لتجميع أعداد جميع العينات في إطار البيانات المسمى totcts وحفظ هذا الجدول الجديد لبيانات العد الخام كملف نصي محدد بعلامات جدولة.

لتحديد ملف تعريف التعبير التفاضلي لكل بناء باستخدام DESeq2 ، أدخل تصميم DESeq2 التجريبي واستخدم مجموعة بيانات DESeq من دالة المصفوفة لإنشاء مجموعة بيانات DESeq لتقدير عوامل الحجم وتشغيل DESeq2. لتقييم جودة التحليل ، استخدم DESeq2 لاستخراج السجل المنظم ، تطبيع العدد. عند استخراج النتائج لكل ملف تعريف نسخي من نتائج DESeq2 ، قم بإجراء مقارنات زوجية في إشارة إلى حالة الضربة القاضية أو المتجه الفارغ الأساسي.

قم بتعديل هذه النتائج باستخدام رموز الجينات HGNC واستخرج البيانات من بيانات DESeq2 كملف واحد مع معرف الجين ENSEMBL ، ورمز HGNC ، وتعبير baseMean ، وبيانات التعبير التفاضلي لجميع التركيبات مع التغيير المزدوج السجل وقيم P الأولية والمعدلة. قم بتقييم التسوية الناجحة للدفعة وتشابه عينة الاهتمام، واستخدم التعليمات البرمجية لاستخدام الأعداد الطبيعية للسجل المنظم للتحقق من تجميع العينة مع تحليل المكونات الرئيسية ومخططات المسافة من عينة إلى عينة. استخدم الأعداد الطبيعية للسجل المنظم لاستخراج 1,000 من الجينات الأكثر تغيرا في مصفوفة واستخدام خريطة حرارية لإجراء تجميع هرمي غير خاضع للإشراف للعينات بناء على هذه الجينات.

لاستخراج المجموعات ذات الأهمية من مخطط الشجيرات ، حدد مستوى مجموعات الاهتمامات المخطط الشجيري التي تظهر وقم بتعيين K مساويا لعدد المجموعات على هذا المستوى. لتحديد المجموعات ذات الأهمية ، أعد رسم خريطة الحرارة المرتبة حسب المجموعة وقم بتصدير قائمة الجينات المرتبطة بكل مجموعة في جدول ، ثم استخدم أداة معلوماتية حيوية مناسبة لتحديد الأدوار البيولوجية لمجموعات الجينات المختلفة التي تم تحديدها ومقارنتها بين الفئات. في هذا التحليل التمثيلي يمكن ملاحظة ضربة قاضية وإنقاذ فعالة مع التركيبات الإيجابية والسلبية.

لاحظ أن الخلايا التي تم إنقاذها من DAF فشلت في تكوين مستعمرات ، مما يشير إلى ضعف التحول الورمي. بعد الانتهاء من التحقق من صحة النسخ المتماثل ، يمكن الحصول على فحوصات النمط الظاهري وأعداد الجينات لمعالجة بيانات تسلسل الحمض النووي الريبي الأولي لجميع العينات لتطبيع الدفعات وتحليلها. يمكن أن يؤدي DESeq2 بدون تطبيع الدفعات إلى عيوب دفعية مربكة ، على الأرجح بسبب التباين البيولوجي الناجم عن مرور الخلايا في الثقافة والاختلافات في معالجة كل دفعة.

بعد تطبيع الدفعات ، يمكن استخدام DESeq2 لإنشاء ملفات تعريف نسخية للتركيبات ذات الأهمية ، بالنسبة إلى خط الأساس. يشير تحليل المكونات الرئيسية لهذه البيانات إلى أن ملف تعريف النسخ ل DAF متوسط ، بين النوع البري EWS / FLI و Delta 22 ، مما يؤكد الوظيفة الجزئية. علاوة على ذلك ، يظهر التجميع الهرمي ل 1،000 من الجينات الأكثر تغيرا عبر العينات أن DAF يفشل في قمع الجينات المستهدفة EWS / FLI ، ويحتفظ جزئيا فقط بنشاط تنشيط الجينات.

يشير تحليل الجينات الأعلى إلى أن فئات الجينات التي ينشطها DAF تختلف وظيفيا عن تلك الأهداف التي يتم تنشيطها بواسطة EWS / FLI حيث يكون DAF غير وظيفي. ومن المثير للاهتمام ، أن DAF أكثر قدرة على إنقاذ الجينات المنشطة بالأقمار الصناعية الدقيقة GGAA ، ولكنها غير قادرة على إنقاذ الجينات المنشطة بالقرب من موقع تقارب عالي. يكمل إقران الناتج النسخي مع فحوصات النمط الظاهري ذات الصلة تحليل دالة البنية.

يمكن للباحثين أيضا استخدام تقنيات أخرى لدراسة الدوافع الميكانيكية لوظائف النسخ المختلفة.