اشتقاق بلورات البروتين مع I3C باستخدام عشوائي Microseed مصفوفة الفرز
يناير 16, 2021
تقدم هذه المقالة طريقة لتوليد بلورات البروتين مشتقة مع I3C (5-أمينو-2،4،6-ثلاثي يودويسوفسثاليك) باستخدام microseeding لتوليد ظروف تبلور جديدة في شاشات مصفوفة متفرقة. يمكن إعداد الصواني باستخدام الروبوتات الاستغناء السائل أو باليد.
هذا هو بروتوكول التبلور تهدف إلى تحسين نمو الكريستال البروتين في حين اشتقاق في وقت واحد البروتين مع جزيء مراحل لتحديد بنية البروتين عن طريق التصوير البلوري بالأشعة السينية. لتحديد بنية الكريستال بالأشعة السينية من البروتين رواية تماما، هي الأمثل ظروف التبلور لإنتاج بلورات الجودة. في حالة وجود بروتين جديد تمامًا ، يجب إدخال الذرات الثقيلة في الكريستال لإنتاج بلورة مشتقة.
يتم جمع بيانات الحيود بالأشعة السينية من الكريستال المشتق ويجب حلها حسابيا لإنتاج بنية بلورية بالأشعة السينية. إن التبلور والاستنباط هما عمليتان شاقتان. ولمعالجة هذه الاختناقات، قمنا بوضع إجراء فرز أمثل يحقق كلا الهدفين في آن واحد.
يستخدم هذا البروتوكول تقنية تم تطويرها سابقًا وتعرف باسم فحص مصفوفة المجهر العشوائية. يتم سحق البلورات أو الترسبات البلورية حتى في الركازات التي يمكن استخدامها لبدء نمو البلورات في ظروف مستقلة تماما. في الوقت نفسه، ونحن نقدم جزيء مراحل تسمى I3C في حالة التبلور.
هذا الجزيء يوفر إشارة شاذة كبيرة والتي تسمح لحل الهيكل من خلال طول موجة واحد الشاذة مناقشة مراحل. للمستخدمين غير مألوفة مع التحجيم التجريبي للهياكل الكريستال نقدم خط أنابيب البرمجيات سهلة الاستخدام لأتمتة جزئيا حل هيكل تكييفه لاستخدام إشارة شاذة من I3C. الخطوة الأولى هي إنشاء مخزون I3C.
قياس من أصل 120 ملليغرام من I3C في أنبوب microcentrifuge. إضافة 200 ميكرولترات من اثنين من هيدروكسيد الليثيوم المولر إلى أنبوب microcentrifuge. يمكن استخدام تسخين الأنبوب من 40 إلى 60 درجة ودوامة للتشجيع على حل.
يجب أن يكون مخزون المول الواحد من محلول Lithium I3C بنيًا. يمكن استخدام طريقتين لإدخال I3C إلى مخزون البروتين. يمكن إضافة الليثيوم I3C مباشرة إلى مخزون البروتين.
3.75 ميكرولترات إلى 30 ميكرولترات من I3C يمكن أن تضاف إلى 150 ميكرولترات من البروتين لإعطاء تركيز بين خمسة و 14 ملليمولار. بعض البروتينات يمكن أن تترسب عند ملامسة تركيزات عالية من I3C. في هذه الحالات، يمكن إضافة الليثيوم I3C إلى عازلة تخفيف البروتين الذي هو العازلة مطابقة عينة البروتين لتركيز النهائي بين 10 إلى 80 ملليمولار.
إضافة 150 ميكرولترات من العازلة تخفيف البروتين إلى 150 ميكرولترات من عينة البروتين. يتم إجراء مسبار زجاجي لسحق البلورات من ماصة باستور الزجاجية. مع موقد بونسن على اللهب الأزرق، تسخين ماصة باستور نحو الوسط.
باستخدام زوج من الملاقط، سحب نهايات ماصة باستور إلى قطر رقيقة أقل من 0.3 ملليمتر. عقد هذا الجزء في الشعلة لفصل ماصة في هذه المرحلة وجولة نهاية ماصة لإنهاء مسبار الزجاج. هذا مثال على كيف يجب أن تبدو الماصات الزجاجية.
قد يتم أيضا طلب السحق الكريستال من البائعين طرف ثالث كبديل لجعل الخاصة بك يتم إنشاء مخزون بزرعة صغيرة عن طريق سحق بلورات البروتين أو الترسبات البلورية. ضع خمسة أنابيب 1.5 مل ميكروسنتريفوغ على الجليد. تحت المجهر الخفيف، حدد أفضل بلورات مورفولوجيا أو الترسبات البلورية التي يمكن التضحية بها.
ل96 تبلور جيدا الصواني فتح البئر عن طريق قطع الشريط البلاستيك الختم. بالنسبة إلى الصواني المنسدلة، يمكن إزالة زلة الغطاء باستخدام الملاقط والمقلوبة على سطح مستو. نقل 70 ميكرولترات من محلول الخزان إلى واحدة من أنابيب microcentrifuge والبرد على الجليد.
إلى الأنابيب المتبقية، ونقل 90 ميكرولترات من محلول الخزان إليها والعودة إلى الجليد إلى البرد. إذا كان حجم الخزان غير كافية هو خزان التبلور الحالي يمكن أن يتم عن طريق خلط الكواشف المناسبة ويمكن استخدامها بدلا من ذلك. تهيج البلورات في قطرة التبلور باستخدام مسبار الزجاج سحق تماما عنه.
يمكن رصد التقدم تحت المجهر حتى لا تكون البلورات أو المواد البلورية مرئية. نقل كل من السائل من قطرة إلى أنبوب microcentrifuge التي تحتوي على 70 ميكرولترات من محلول الخزان. مزيج عن طريق الأنابيب صعودا وهبوطا.
نقل اثنين إلى ثلاثة ميكروليتر من الخليط مرة أخرى إلى البئر وشطف البئر عن طريق الأنابيب صعودا وهبوطا. نقل الخليط مرة أخرى إلى أنبوب microcentrifuge. وينبغي تكرار هذه الخطوة شطف مرة أخرى.
وينبغي أن تبقى أنبوب microcentrifuge الباردة من هذه النقطة إلى الأمام لتجنب ذوبان الذرات الدقيقة. دوامة الأنبوب في السرعة القصوى في أربع درجات لمدة ثلاث دقائق تقشعر لها الأبدان الأنبوب على الجليد بانتظام لمنع ارتفاع درجة الحرارة. جعل واحد من كل 10 المخففات التسلسلية من مخزون البذور عن طريق نقل تسلسلي 10 ميكرولترات بين حلول الخزان المبردة.
بين التخفيفات مخزون البذور، ينبغي أن يكون دوامة الأنبوب. وينبغي تخزين مخزونات البذور التي لن تستخدم على الفور، في ثلاجة ناقص 80 درجة فائقة البرودة. ويمكن إعداد 96 مصفوفة مصفوفة عشوائية جيدا الشاشة باستخدام السائل الاستغناء عن الروبوت.
وضع مخزون البذور، حل مخزون البروتين تكملها I3C وشاشة التبلور في الروبوت. باستخدام الروبوت نقل 75 ميكروليتر من شاشة التبلور إلى علبة 96 جيدا. إضافة ميكرولتر واحد إلى قطرة التبلور و 74 ميكرولترات إلى الخزان.
نقل ميكرولتر واحد من البروتين المكمل مع I3C إلى قطرة التبلور. نقل 0.1 ميكرولترات من مخزون البذور إلى انخفاض التبلور. ختم لوحة باستخدام ختم الشريط.
يمكن إعداد شاشات الإسقاط المعلقة في 24 صواني تبلور قطرة معلقة. الشحوم حواف الآبار قطرة معلقة. نقل 500 ميكرولترات من محلول التبلور إلى الخزان.
بالقرب من مركز شريحة غطاء زجاجي وضع قطرة ميكرولتر واحدة من حل التبلور. إلى هذا الانخفاض، إضافة ميكرولتر واحد من البروتين المكمل مع الليثيوم I3C و 0.1 ميكرولترات من مخزون البذور. عكس الشريحة الغطاء وختم التبلور جيدا عن طريق دفع الشريحة الغطاء في الشحوم.
يتم احتضان قطرة معلقة وختم الصواني قطرة في درجة حرارة ثابتة للسماح للبلورات لتشكيل. وينبغي أن يتم تفتيشها بانتظام تحت المجهر لنمو البلورات. بعد الحصول على بيانات الحيود ودمجها وتحجيمها كما هو موضح في البروتوكول المكتوب المرافق ، يمكن استخدام خط أنابيب تحديد بنية الكريستال الآلي التلقائي للريكشو لحل مشكلة المرحلة ونموذج البروتين.
في الصفحة المقصودة Auto-Rickshaw، انقر على زر المتابعة. أدخل البريد الإلكتروني المؤسسي الخاص بك في نموذج ويب Auto-Rickshaw وانقر فوق متابعة تشغيل Auto-Rickshaw. للبروتينات دون قالب homology موتو تشغيل بروتوكول SAD من السيارات ريكشو في الوضع المتقدم.
أدخل المعلمات المطلوبة. حدد البروتين كنوع الجزيء. أدخل الطول الموجي لجمع البيانات في angstroms.
مثل ذلك مثل أنا كعنصر تحتية للإشارة إلى استخدام ذرات اليود. حدد نوع الهيكل الفرعي I3C للإشارة إلى أن I3C كان جزيء المراحل. حدد sub_direct كأسلوب تحديد البنية الفرعية.
حدد ثلاثة كرقم من الهياكل الفرعية المتوقعة لكل مونومر. أدخل واحدًا كقطع حجز للبحث عن البنية الفرعية. وهذا يسمح للسيارات - ريكشو لتحديد تلقائيا قطع القرار مناسبة.
أدخل عدد المخلفات في مونومر واحد، مجموعة الفضاء لمجموعة البيانات وعدد الجزيئات في وحدة غير متماثلة استناداً إلى معامل ماثيوز. حدد مستوى النشر المناسب لبيانات الأشعة السينية التي تناسب احتياجاتك. إدخال البيانات الشاذة كملف مجموعة فارغة.
إدخال تسلسل البروتين الخاص بك كملف SEQ أو PIR أو TXT. أدخل عنوان البريد الإلكتروني المؤسسي الخاص بك. يتم تسليم النتائج إليك عبر رابط ويب يتم إرساله إلى عنوان البريد الإلكتروني المقدم.
إذا فشل Auto-Rickshaw في حل البنية باستخدام البنية الفرعية المحددة للتحقق من البنية الفرعية يمكن أن يساعد في حل البنية وإصلاحها. قم بتنزيل قائمة مواقع الذرات الثقيلة من صفحة نتائج Auto-Rickshaw. وهو ارتباط تشعبي يسمى مواقع الذرة الثقيلة.
هذا سيتم تحميل ملف نصي مع مواقع ذرة الثقيلة. تغيير ملحق الملف من txt إلى pdb. افتح ملف pdb في Coot.
بدوره على التماثل لرؤية جميع الذرات الثقيلة من وحدات غير المتماثلة المجاورة. قياس المسافات بين الذرات الثقيلة، بما في ذلك عبر وحدات غير متناظرة. I3C سوف تظهر على أنها مثلث متساوي الأضلاع مع طول الجانب من ستة angstroms.
وجود مثلث مع هذه الأبعاد يشير إلى مواضع تلك الذرات الثقيلة صحيحة. إذا كان تشغيل Auto-Rickshaw غير صحيح، يمكن اختبار إعدادات Auto-Rickshaw الأخرى كما تمت مناقشتها في البروتوكول المكتوب. تم اختبار طريقة I3C RMMS على اثنين من البروتينات، بيض البيض الدحن lysozyme باستخدام شاشة في HT من هامبتون للبحوث ومجال بروتين أورف11 ليسين من bacteriophage P68.
تم إعداد شاشات كاملة لكل بروتين الموافق لشاشة التحكم بدون I3C أو microseed ، الشاشة مع microseed المضافة ، الشاشة مع I3C ، وأخيرا الشاشة مع I3C و microseed. إضافة I3C إلى شاشة الكريستال لا يبدو لزيادة عدد الزيارات التبلور. مع بيض البيض lysozyme، انخفض عدد الشروط من 31 إلى 26.
مع المجال Orf11 تم العثور على حالة إصابة واحدة في شاشة التحكم. إضافة I3C إلى الشاشة أعطى أيضا ضربة واحدة في نفس الظروف. إضافة microseed إلى البئر أدى إلى زيادة كبيرة في عدد حالات الإصابة مما أدى إلى زيادة 2.1 وستة أضعاف لبيضة البيض lysozyme وorf11 المجال على التوالي.
هذه النتيجة متسقة مع دراسات أخرى اختبار RMMS. الأهم من ذلك ، إضافة I3C و microseed إلى الشاشة أيضا زيادة عدد حالات الاصابة بالنسبة لشاشة التحكم مما يدل على زيادة 2.3 وسبعة أضعاف بيض بيض البيض lysozyme والمجال Orf11 على التوالي. وهذا يدل على أن طريقة I3C RMMS يمكن أن تنتج بكفاءة ظروف جديدة للبلورات المشتقة.
ويمكن حصاد بلورات من هذه الظروف واستخدامها في حل هيكل الكريستال. يمكن حل كل من هيكل بيضة البيض lysozyme Orf11 البيض النطاق مع SAD مراحل على خط أنابيب السيارات ريكشو، وذلك باستخدام إشارة شاذة من I3C مما يدل على اشتقاق ناجحة من قبل شاشة I3C RMMS. لقد قدمنا بروتوكول بسيط وفعال لإنتاج بلورات عالية الجودة مشتقة مع جزيء I3C مراحل.
فإنه يقلل من عدد من الشاشات وخطوات التعامل مع البلورية، وبالتالي هو ذات أهمية خاصة لعلماء الأحياء الهيكلية دراسة البروتينات الجديدة. ونحن نوصي بشدة تحسين حجم الكريستال من خلال اختبار مختلف الأسهم البذور dilutions التي تم إجراؤها أثناء إعداد البذور الأسهم. ويتم الانتهاء من هذه الخطوة بعد شاشات الأولية قد تم القيام به.
I3C متاح على نطاق واسع وانها غير مكلفة لشراء وهكذا نعتقد أن هذه الطريقة هي في متناول معظم مختبرات البيولوجيا الهيكلية.
نظرة عامة
تقدم هذه المقالة بروتوكول تبلور يحسن نمو بلورات البروتين أثناء اشتقاقها باستخدام I3C لعلم البلورات بالأشعة السينية. تستخدم الطريقة فحص مصفوفة البذور الصغيرة العشوائية لتحسين ظروف التبلور.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلم
- تبلور البروتين
- علم البلورات بالأشعة السينية
- علم الأحياء البنيوي
الخلفية
- التبلور ضروري لتحديد هياكل البروتين.
- الاشتقاق بذرات ثقيلة ضروري لتحديد الطور في علم البلورات بالأشعة السينية.
- يمكن أن تكون الطرق التقليدية كثيفة العمالة وتستغرق وقتًا طويلاً.
- يمكن لتقنيات البذر الصغير تحسين نتائج التبلور.
غرض الدراسة
- تطوير بروتوكول مبسط لتبلور البروتين والاشتقاق.
- تقديم I3C كجزيء لتحديد الطور لتعزيز تحديد بنية الأشعة السينية.
- توفير خط أنابيب برمجي سهل الاستخدام لحل البنية.
الطرق المستخدمة
- إعداد محاليل I3C الاحتياطية.
- سحق بلورات البروتين لإنشاء بذور صغيرة.
- إعداد شاشات التبلور باستخدام روبوتات توزيع السوائل.
- مراقبة نمو البلورات وتحسين الظروف.
النتائج الرئيسية
- الجيل الناجح للبلورات البروتينية المستخلصة.
- تحسين ظروف التبلور من خلال البذر الصغير.
- استخدام فعال لـ I3C لتحديد الطور في علم البلورات بالأشعة السينية.
- أتمتة أجزاء من عملية حل البنية.
الاستنتاجات
- يحسن البروتوكول من كفاءة تبلور البروتين.
- يحسن البذر الصغير بشكل كبير من جودة البلورات التي تم الحصول عليها.
- يعمل I3C كعامل فعال لتحديد الطور لتحديد البنية.
الأسئلة الشائعة
Executive Industry Relevance
This protocol addresses a key bottleneck in structural biology by combining protein crystallization with heavy-atom derivatization to enable experimental phasing for novel targets. By integrating random microseed matrix screening with I3C derivatization, it reduces the number of discrete steps required to obtain phase information, accelerating early-stage target validation. The approach supports de-risking of structural hypotheses in discovery pipelines where homology models are unavailable.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables experimental phasing for novel proteins lacking homology models, supporting target validation through direct structure determination.
- Operational Value: Combines crystallization and derivatization in a single workflow, reducing hands-on time and sample handling.
- Predictive Value: The equilateral triangle arrangement of iodine atoms in I3C allows rapid validation of the anomalous substructure, increasing confidence in phased models.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates derivatized crystal hits suitable for downstream data collection and phasing, enabling reliable electron density maps.
- Operational Value: Uses liquid dispensing robots to set up 96-well random microseed matrix screens, improving reproducibility and throughput.
- Scalability: Microseed stocks can be serially diluted and stored at -80°C, allowing reuse across multiple screening campaigns.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Provides a path from crystallization to automated structure solution via the Auto-Rickshaw pipeline, supporting preclinical target characterization.
- Mechanistic De-risking: Successful SAD phasing using I3C-derived anomalous signal validates the structural model, reducing uncertainty in target mechanism.
- Disease-Relevant System: Demonstrated on hen egg white lysozyme and Orf11 lysin domain, showing applicability to diverse protein classes including antimicrobial targets.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the early discovery continuum, linking crystallization to structure solution for targets requiring experimental phasing, particularly when computational methods fail due to lack of templates.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by enabling 3D structure determination of novel proteins, clarifying binding sites and domain architecture.
- Screening: Produces reproducible crystallization conditions through microseeding, increasing hit rates for derivatized crystals as shown by 2.3- to 7-fold improvements over controls.
- Analytics: Outputs anomalous diffraction data suitable for SAD phasing, with substructure validation via I3C’s characteristic six-angstrom equilateral triangle.
- Translational Research: Connects to downstream validation through automated model building in Auto-Rickshaw, enabling progression to preclinical studies.
- Enterprise Reuse: Microseed stocks and I3C protocols are standardized and storable, supporting platform reuse across multiple targets.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Provides experimental phase information, reducing reliance on molecular replacement and increasing success rate for novel targets.
- Operational Value: Streamlines workflow by combining two labor-intensive steps (crystallization and derivatization) into one integrated screen.
- Strategic Value: Accelerates go/no-go decisions in target validation by enabling rapid structure determination.
- Portfolio Impact: Improves confidence in target selection through high-quality, phased structures, supporting risk-adjusted advancement.
Implementation Considerations
- Expertise in protein crystallization, microseeding, and handling of heavy atom compounds is required.
- Access to liquid dispensing robots, X-ray diffraction equipment, and structure solution software (Auto-Rickshaw, Coot) is necessary.
- Standardization across teams benefits from predefined I3C stock protocols and microseed storage procedures.
- Adaptation to different protein systems may require optimization of I3C concentration to avoid precipitation, as noted for sensitive targets.
- Practical limitations include the need for initial crystal or precipitate to generate microseeds and the dependence on sufficient anomalous signal for SAD phasing.
