الأيض الكمي من Saccharomyces Cerevisiae باستخدام الكروماتوغرافيا السائلة إلى جانب قياس الطيف الكتلي الترادفي

هذا البروتوكول له العديد من المزايا على الأيض الخميرة المستخدمة حاليا لأنه يحتوي على خصوصية عالية، وحساسية عالية، وأيضا يمكن أن لمحة عن العديد من فئات مختلفة من الأيض، بما في ذلك ايزوميريك، إيزوباك، hydrophilic، والجزيئات الكارهة للماء. طريقة إخماد المستخدمة في هذا البروتوكول توقف جميع ردود الفعل الأنزيمية في حين يقلل بشكل كبير من تسرب الأيض من الخلايا. مكتبة MS1 المضمنة في هذا البروتوكول من تشغيل MS2 مختلفة.

بعد ثقافة بين عشية وضحاها في 30 درجة مئوية و 200 ثورة في الدقيقة الواحدة، وتحديد عدد خلايا الخميرة لكل ملليلتر من الثقافة وإضافة خمسة ملليلتر من محلول الأسهم المعقمة 20٪ من الجلوكوز إلى كل من اثنين من قوارير Erlenmeyer التي تحتوي على 45 ملليلتر من المتوسط YP المعقمة لكل قارورة. استخدام ماصة نقل معقمة لإضافة خمس مرات 10 إلى خلايا الخميرة السابعة إلى كل قارورة وتنمو خلايا الخميرة لمدة 24 ساعة إضافية على الأقل في 30 درجة مئوية في 200 ثورة في الدقيقة الواحدة. لاستخراج المستقلب، بعد الثقافة، وجمع خلايا الخميرة عن طريق الطرد المركزي وإزالة بسرعة supernatant.

ضع الأنبوب على الجليد الجاف وأضف ملليلترين من ناقص 20 درجة مئوية من الكلوروفورم، ومليلتر واحد من ناقص 20 درجة مئوية من الميثانول، ومليلتر واحد من الماء النقي نانو الباردة الجليد، و 200 ميكرولتر من 425 إلى 600 حبة زجاجية مغسولة حمض ميكرون إلى الخلايا. عندما تمت إضافة الخرز، ضع الأنبوب المغطى بورق الألومنيوم في مجموعة حامل أنبوب رغوي مع تجنيب ودوامة العينة لمدة 30 دقيقة بسرعة متوسطة عند أربع درجات مئوية لتسهيل استخراج المستقلب. بعد ذلك، احتضان الأنبوب لمدة 15 دقيقة على الجليد قبل الطرد المركزي العينة للسماح بفصل المرحلة المائية العليا من الحطام الأوسط والبروتين والمراحل العضوية السفلية.

استخدام micropipette لنقل ما يقرب من 400 ميكرولتر من المرحلة المائية العليا إلى أنبوب غسلها ووصفت 1.5 ملليلتر تحتوي على 800 ميكرولتر من ناقص 20 درجة مئوية acetonitrile. ثم طرد العينة ونقل 800 ميكرولتر من الجزء العلوي من supernatant إلى قارورة الطيف الكتل المسمى لتخزين درجة الصفر حتى تحليل الطيف الكتلي الترادفي الكروماتوغرافيا السائلة. لفصل الأيض المستخرج، ultrasonicate قارورة العينة لمدة 15 دقيقة، تليها ثلاث دوامات 10 ثانية في درجة حرارة الغرفة.

بعد الدوامة، ضع القارورة في صفيحة البئر الخاصة بالكروماتوجرافي السائل وحدد العمود إلى 45 درجة مئوية بمعدل تدفق 0.25 ملليلتر في الدقيقة ولوحة البئر إلى درجة صفر مئوية. ثم استخدم الجدول لتعيين تدرجات اللونيات السائلة للتحليل. بعد الانفصال، استخدم 10 ميكرولتر حجم عينة من الحقن في كل من الأوضاع المؤينة للرذاذ الكهربائي الإيجابية والسلبية في مطياف الكتلة مجهزة تأين الرذاذ الكهربائي ساخنة لتحديد وتحديد الأيض للذوبان في الماء.

في نهاية التحليل، افتح البيانات الأولية في برنامج تحليل مركب مناسب واستخدم مكتبة تجزئة الطيفية الشاملة لمطابقة أطياف الكتلة لشرح الأيضات المحددة في التحليل. ويمكن أيضا تحديد الكتل الدقيقة لأنماط MS1 والنظائر للسماح بالتعليقات التوضيحية للم المستقلبات باستخدام قواعد البيانات عبر الإنترنت. ثم استخدم مكتبة قواعد البيانات والأطياف للبحث عن أطياف MS2 للبيانات الخام.

في اليوم التالي، بعد إخماد خلايا الخميرة، يغسل الخلايا بدقة مع 15 ملليلتر من العازلة ABC وجمع الخلايا عن طريق الطرد المركزي. Resuspend بيليه في ملليلتر واحد من العازلة ABC الطازجة وإضافة 500 ميكرولتر من محلول يوديد بروبيديوم إلى الخلايا. دوامة العينة ثلاث مرات لمدة 10 ثوان لكل دوامة واحتضان الخلايا لمدة 10 دقائق على الجليد المحمية من الضوء.

في نهاية الحضانة، وجمع الخلايا عن طريق الطرد المركزي وغسل الخلايا ثلاث مرات مع ملليلتر واحد من العازلة ABC الطازجة لكل غسل. بعد الغسيل الأخير ، أعيد إنفاق بيليه في 300 ميكرولتر من العازلة ABC الطازجة وإضافة 10 ميكرولترات من تعليق الخلية الناتج إلى شريحة المجهر. استخدم مجهر مضان لالتقاط تباين التداخل التفاضلي وصور المجهر الفلوري للخلايا مع المرشحات التي تم تعيينها إلى طول موجي مثير قدره 593 نانومتر وطول موجي للانبعاثات قدره 636 نانومتر.

ثم استخدم برنامج تحليل الصور المناسب لحساب إجمالي عدد خلايا الخلايا في صور brightfield و fluorescence ، وتحديد كثافة الفلورسينس من تلطيخ للخلايا الفردية. تسبب طريقة إخماد الخلايا المعدلة ضررا أقل بكثير لغشاء البلازما وجدار الخلية من الميثانول غير المخزن بنسبة 80٪ عند طريقة إخماد 40 درجة مئوية ناقص. في الواقع ، تقريبا جميع الخلايا التي تعرضت لإرواء باستخدام الطريقة المعدلة تظهر انبعاثات مضان حمراء ، وهي سمة من سمات خلايا الخميرة التي لا يتلف فيها غشاء البلازما وجدار الخلية.

وعلى النقيض من ذلك، فإن جميع الخلايا تقريبا التي تعرضت للإرواء باستخدام الميثانول غير المخزن بنسبة 80٪ عند طريقة 40 درجة مئوية أظهرت انبعاثا مضان أخضر ، وهو سمة من سمات خلايا الخميرة التي يتضرر فيها غشاء البلازما وجدار الخلية بشكل كبير. طريقة إخماد الخلايا المعدلة يسبب أيضا تسرب أقل بكثير من الأيض للذوبان في الماء من خلايا الخميرة من غير المخزنة مؤقتا 80٪ الميثانول في ناقص 40 درجة مئوية طريقة إخماد. قيم التحول وقت الاحتفاظ من معايير المستقلب القابلة للذوبان في الماء هي أقل بكثير والأشكال الذروة هي أكثر حدة إلى حد كبير لعمود المرحلة zwitterionic بالمقارنة مع عمود المرحلة العكسية.

ميزة أخرى لطريقة قياس الطيف الكتلي الترادفي الكروماتوغرافي السائل هي القدرة على استخدام عمود المرحلة zwitterionic لفصل الأيضات المختلفة القابلة للذوبان في الماء بكفاءة مع خصائص هيكلية ومادية وكيميائية متنوعة. تأكد من القيام يوديد البروبيديوم يقف في الظلام وتأكد أيضا من جمع المرحلة العليا في حين لا يزعج المرحلة الوسطى. إذا كان لا يمكن أن يكون أي MSP المشروح بسبب عدم وجود مكتبة الطيفية MS2، ثم استخدام NMR لتوضيح هذه البنية.