التكامل بوساطة φC31 الموجهة بالموقع وتبادل الكاسيت في نواقل الأنوفيليس للملاريا

يدعم هذا البروتوكول توصيف دور جينات البعوض المشاركة في مجموعة متنوعة من المسارات الفسيولوجية ، بما في ذلك ، على سبيل المثال ، مقاومة الحشرات وتطور طفيليات الملاريا. تدفع هذه الطريقة إدخال الجينات المحورة في مواقع جينومية واحدة مميزة مسبقا ، وبالتالي تسمح بمقارنة الأنماط الظاهرية الناتجة عن الجينات المحورة البديلة بشكل فعال لتجنب مسألة التأثير الموضعي. يمكن تطبيق هذه الطريقة على مجموعة متنوعة من أنواع الحشرات ذات الأهمية العامة والزراعية وتمتد تطبيقاتها على نطاق واسع من البكتيريا إلى خلايا الثدييات.

ابدأ بتصميم بلازميدات مانحة attB تحمل علامة الفلورسنت السائدة ومواقع إعادة تركيب attB والشحنة الجينية المحورة المطلوبة. استخدم موقعا واحدا ل attB لدمج البلازميد الكامل الذي يحمل الكاسيت المعدل وراثيا أو موقعين مقلوب attB لتبادل الكاسيت. تنقية البلازميدات المانحة والمساعدة، باستخدام مجموعة تنقية خالية من السموم الداخلية.

اجمع بين بلازميد المتبرع الموسوم attB الذي يحمل الجين المتحول محل الاهتمام والبلازميد المساعد الذي يحمل التكاملات للحصول على مزيج بتركيز نهائي قدره 350 نانوغرام لكل ميكرولتر من بلازميد المتبرع و 150 نانوغرام لكل ميكرولتر من البلازميد المساعد. عجل الحمض النووي عن طريق إضافة 0.1 حجم من ثلاثة خلات الصوديوم المولية و 2.5 حجم من الجليد البارد 100 ٪ من الإيثانول ، ثم دوامة. يجب أن يكون الراسب الأبيض مرئيا على الفور.

اغسل الكريات وأعد تعليقها في مخزن مؤقت للحقن للوصول إلى تركيز نهائي إجمالي قدره 500 نانوغرام لكل ميكرولتر. ثم قم بإعداد أليكوتس من 10-15 ميكرولتر لكل منها وتخزينها عند سالب 20 درجة مئوية. يغذي الدم البعوض البالغ من العمر أربعة إلى سبعة أيام من خط الالتحام المطلوب ونظرائه من النوع البري قبل 72 ساعة من الحقن الدقيق.

قم بإجراء الحقن الدقيقة لجنين Anopheles gambiae في كلوريد الصوديوم 25 ملليمولار عن طريق استهداف القطب الخلفي للجنين بزاوية 45 درجة. قم بإجراء حقن الجنين الدقيقة Anopheles stephensi في زيت الهالوكربون عن طريق استهداف القطب الخلفي بزاوية 30 درجة. مباشرة بعد الحقن ، انقل البيض إلى طبق بتري مملوء بالماء المقطر المعقم وأعاده إلى الظروف الحشرية.

عند الفقس ، انقل يرقة G0 إلى صينية بالماء المقطر المملح يوميا وخلفها إلى الشرانق. فرز الشرانق G0 حسب الجنس تحت منظار مجسم. اسمح للذكور بالظهور في أقفاص منفصلة في مجموعات من ثلاثة إلى خمسة وأضف عشرة أضعاف عدد الإناث البرية المتطابقة مع العمر.

السماح للإناث بالظهور في أقفاص منفصلة في مجموعات من 10 إلى 15 وإضافة عدد متساو من الذكور من النوع البري المطابق للعمر. السماح للبالغين بالتزاوج لمدة أربعة إلى خمسة أيام وتزويد الإناث بوجبة دم. جمع البيض والخلفية الناشئة الجيل القادم G1s.

اجمع يرقة G1 و L3 و L4 في طبق بتري مبطن بورق ترشيح مبلل أو على شريحة مجهر وقم بفحصها باستخدام مجسمة فلورسنت لوجود العلامة المقدمة مع البضائع الموسومة ب attB. بالنسبة لتصميمات attB المفردة ، قم بفحص وجود العلامة الجديدة والموجودة مسبقا. بالنسبة لتصميمات attB المزدوجة لتبادل الكاسيت ، شاشة لوجود العلامة الجديدة وفقدان العلامة الموجودة مسبقا.

فرز تحويل الشرانق G1 حسب الجنس وعبورها بشكل جماعي مع الجنس الآخر من الأفراد من النوع البري المطابق للعمر. اسمح للبالغين بالتزاوج لمدة أربعة إلى خمسة أيام وتقديم وجبة دم. بالنسبة لتجارب التكامل الفردية ، اجمع البيض مباشرة من الصليب الجماعي.

بالنسبة لتجارب تبادل الكاسيت ، قم بجمع البيض من الإناث العازبات والحفاظ على النسل منفصلا حتى يكتمل التقييم الجزيئي بسبب الوجود المحتمل لاتجاهين بديلين للكاسيت. فحص ذرية G2 لوجود علامة الفلورسنت وتخصيص مجموعة فرعية من الأفراد الإيجابيين G2 للتحليل الجزيئي. قم بإرجاع الباقي إلى مرحلة البلوغ.

إجراء التحقق الجزيئي من مواقع الإدراج باستخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل كما هو موضح في مخطوطة النص. من أجل التكامل الفردي ، تأكد من أن موقع الإدخال المتوقع يحمل بنية الإرساء الأصلية ، بالإضافة إلى التسلسل الكامل للبلازميد المانح بين الموقعين الهجينين attL و attR. بالنسبة لتبادل الكاسيت، تأكد من أن موقع الإدراج المتوقع مطابق لموقع خط الإرساء حيث تحل مواقع attL المقلوبة المختلطة محل مواقع attP المقلوبة الأصلية ويحل قالب التبادل محل الكاسيت الموجود أصلا بينهما.

تم استخدام البروتوكول لإنشاء خط أنوفيليس مستقر معدل وراثيا في حوالي 10 أسابيع. تم إجراء التحقق من صحة النمط الظاهري للتحول عن طريق فحص علامات الفلورسنت التي ينظمها مروج 3xP3 هنا. تم الحصول على خط Anopheles stephensi جديد عن طريق إدخال كاسيت يحمل علامة DS حمراء في خط الالتحام المميز ب CFP مما أدى إلى تعبير ذرية G1 عن كلا العلامتين كما هو موضح في التألق الأحمر والأزرق في العينين.

تؤدي تصميمات تبادل الكاسيت إلى استبدال العلامة التي تم إدخالها في الأصل في خط الالتحام بعلامة البلازميد المانحة. وقد تجلى تبادل العلامات هذا في خط التحام Anopheles gambiae حيث فقدت علامة CFP واكتسبت علامة YFP مما أدى إلى تألق العين الصفراء والحبل العصبي. في بعض الأحيان ، يمكن أن يؤدي RMCE إلى حدث تكامل واحد بدلا من تبادل الكاسيت المعدل وراثيا المطلوب حيث يتم تمييز اليرقة بكل من علامات CFP الأصلية وعلامات YFP الجديدة.

عند فحص وجود علامة الفلورسنت ، من الأهمية بمكان التمييز بين إشارتها والتألق التلقائي المحتمل في الخلفية. إن زيادة التكبير والتركيز على الأنسجة والأعضاء التي يتوقع أن يكون فيها التألق مدفوعا من قبل المروج أمر ضروري لتحديد الأفراد الإيجابيين الحقيقيين ل CFP. كما تم تقييم المحولات الفردية جزيئيا عبر تفاعل البوليميراز المتسلسل لتأكيد موقع الإدخال المتوقع.

يظهر هنا التحقق من PCR في الأفراد من خط Anopheles gambiae المتبادل. حتى تقنية الحقن الدقيقة المناسبة ، والتصميم الدقيق وإعداد البلازميدات المانحة والمساعدة ، وكذلك اتباع مخطط تربية البعوض المناسب هي المفتاح للحصول على الأفراد المعدلة وراثيا. يمكن استخدام هذا الإجراء لإدراج العناصر التي تسبب الإفراط في التعبير الجيني أو إسكات الصوت ، على سبيل المثال ، نظام GAL4 / UAS ، وكذلك عناصر محرك الجينات والجزيئات المضادة للأمراض للسيطرة الوراثية للبعوض.