حبة تحميل البروتينات والأحماض النووية في الخلايا البشرية الملتصقة

تحميل الخرز هو المقايسة غير مكلفة لتحميل الغشاء، جزيئات منيعة في الخلايا الملتصقة الحية. وقد ثبت أن هذا البروتوكول مفيد للغاية لتحميل المسابير لخلية واحدة أو جزيء واحد أو تجارب المجهر الفلوري. تحميل حبة يسمح للباحثين لتحميل بسرعة جميع أنواع الجزيئات، بما في ذلك البروتينات، الحمض النووي، الحمض النووي الريبي، الجسيمات الاصطناعية، أو مزيج من هذه في وقت واحد في خلايا واحدة.

عند إجراء تحميل حبة لأول مرة ، من المهم اختبار قوة التنصت. تستجيب خطوط الخلايا بشكل مختلف لتحميل الخرز. وهكذا يمكن تعديل عدد وقوة الصنابير لتحميل الخلية الأمثل مع تقليل خلية pealing.

لإثبات الإجراء ماثيو ساكستون وأنا سينضم إلينا زميلان، الدكتورة أماندا كوك وغابرييل غاليندو. ابدأ بقياس ما يقرب من خمسة ملليلترات من الخرز الزجاجي في أنبوب مخروطي 50 ملليلتر. أضف 25 ملليلتر من هيدروكسيد الصوديوم الضرولي إلى الأنبوب واخلطه برفق لمدة ساعتين باستخدام شاكر أو دوار.

تدور أسفل أنبوب الخرز لفترة وجيزة في جهاز الطرد المركزي إذا كانت الخرز في التعليق، ثم decant هيدروكسيد الصوديوم مع الاحتفاظ أكبر عدد ممكن من الخرز. غسل الخرز جيدا مع المياه الصف ثقافة الخلية حتى درجة الحموضة محايدة وdecant الماء في كل مرة. استخدم شريط اختبار درجة الحموضة على السائل السائل لتأكيد درجة الحموضة المحايدة ، ثم اغسل الخرز جيدا بالإيثانول بنسبة 100٪ ، مرتين إلى ثلاث مرات.

ينتفز الإيثانول في كل مرة. جفف الخرز ورشها لتشكيل طبقة رقيقة داخل وعاء معقم. ثم اترك الحاوية مفتوحة داخل خزانة السلامة البيولوجية لتجفيف الخرز بين عشية وضحاها.

اضغط برفق أو هز الحاوية والتحقق من أن الخرز لديها نسيج ساندي دون تكتل أو تقشر لضمان أن الخرز جافة تماما. إضافة الخرز إلى الجهاز وتغطية افتتاح كامل من غرفة عقد حبة باستخدام شبكة البولي بروبلين أو المواد المكافئة مع فتحات 105 ميكرومتر للسماح للخرزات بالمرور من خلال. المشبك شبكة بين نهايات الذكور والإناث من غرفة التصوير المعدنية القابلة لإعادة الاستخدام، ثم ختم بإحكام مع الفيلم شمعي والأشعة فوق البنفسجية تعقيم الجهاز لمدة 15 دقيقة.

يمكن الآن استخدام جهاز محمل الخرز لإجراء مئات من عمليات الفحص التحميل. تخزين الجهاز في وعاء جاف المجففة بواسطة هلام السيليكا أو غيرها من وسائل المجففة وختم عليه. إذا أصبحت الخرز تفريغ جافة تماما وتعقيم محمل حبة واستبداله بالخرز الطازج، كما هو موضح سابقا.

إزالة المتوسطة من الخلايا وتنشق بلطف كل وسيلة من جميع أنحاء حواف الغرفة. ثم إمالة الغرفة في زاوية 45 درجة تقريبا وإزالة قطرة المتبقية من وسائل الإعلام في وسط الدقيقة جيدا. ماصة حل تحميل حبة بلطف على الزجاج الجزئي موجودة بشكل جيد في وسط الغرفة.

استخدام جهاز تحميل حبة لتفريق بلطف طبقة واحدة من الخرز الزجاجي على رأس الخلايا. تأكد من أن الخرز تغطي الخلايا تماما. قرصة الغرفة بإصبعين، ورفعه حوالي بوصتين واسقاطه بحزم باستخدام قوة تعادل تقريبا لإسقاط الطبق من هذا الارتفاع بلطف إضافة المتوسطة مرة أخرى إلى الغرفة عن طريق الأنابيب ببطء على الجانب البلاستيكي من الغرفة.

يستنشق أي حبات عائمة دون إزعاج الخلايا ، يجب إجراء تحميل الخرز بالكامل بسرعة نسبية. حتى لا تجف الخلايا عندما تكون دون وسيطة. ثم احتضان الخلايا 4.5 إلى ساعتين في الحاضنة.

قبل التصوير غسل الخلايا ثلاث مرات مع المتوسطة لإزالة الخرز ومكونات التحميل الزائدة في محلول التحميل. قم بتصوير الخلايا فورا أو عند الحاجة إليها من قبل التجربة باستخدام التعليمات الموجودة في المخطوطة النصية. الخلايا التي تم تحميلها بنجاح حبة، دائما تقريبا كان Cy3-Pa57 و A488-H3K11ac وصفت البروتينات معا.

كما تم إدخال ميكروغرام واحد من الحمض النووي البلازميد والترميز GFP و 0.5 ميكروغرام من البروتين المسمى Cy3 في الخلايا عن طريق تحميل الخرز المعبر عنها وتصورها. 40٪ من الخلايا كانت حبة محملة بروتين فاب و 21٪ من الخلايا المحملة حبة التعبير عن البلازميد المحملة الأساسية. عبرت الخلايا المحملة بالخرز عن مستويات متفاوتة من البلازميد.

وأظهرت نتيجة اختبار نسبة فيشر أنه على الرغم من أن البروتينات واحد واثنين لديها توزيعات كثافة مماثلة، كان لكل بروتين توزيع أصغر بكثير من البلازميد. كانت مستويات البروتينات المحملة بالخرز تحتوي على خلية صغيرة لتباين الخلايا وكانت مستويات اثنين من البروتينات المحملة في وقت واحد مرتبطة ارتباطا وثيقا ببعضها البعض. لم يكن لتحميل الخرز المناسب أي تأثير ملحوظ تقريبا على عدد خلايا U2OS البشرية أو مورفولوجياها عند تصويرها مباشرة قبل وبعد وبعد 24 ساعة من تحميل الخرز.

تسبب سوء تحميل حبة مع الخرز المفرط وقوة التنصت فقدان الخلية، ومورفولوجيا الخلية الفقراء ومجموعات من الخرز المتبقية على الزجاج الغطاء. على الرغم من أن الخلايا ويعتقد أن الخضوع للأضرار الميكانيكية خلال خلايا تحميل حبة نمت وانتشرت في غرفة محملة حبة بشكل صحيح. ولوحظ أيضا أن حبة محملة الخلايا، والخضوع لتقسيم الخلايا.

تم تحميل RPE1 وخطوط خلايا HeLa مع فاب لإثبات براعة تقنية تحميل الخرز. كما تم تحميل خلايا U2OS مع حبة Cy5-RNA 9-mer، وCy3-DNA 28-mer معا. عند محاولة هذا البروتوكول تأكد من إضافة طبقة أحادية فقط من الخرز إلى الخلايا منذ الخرز كثيرة جدا تسبب الخلايا لفصل.

حتى بعد فترة وجيزة 30 دقيقة الانتعاش وظيفة لخلايا تحميل حبة جاهزة للتصوير إما على الفور أو ساعات إلى أيام في وقت لاحق، إذا كان الإجراء يتطلب المزيد من الخطوات مثل تلطيخ، التي يمكن القيام به بعد فترة الانتعاش كذلك.