التجارب المختبرية للأقفاص الصغيرة للبعوض أنوفيلين المهندسة وراثيا

البروتوكول الموصوف هنا مناسب لتقييم أداء البعوض المعدل وراثيا والمقارنات مع نظرائه من النوع البري في تجارب الأقفاص المختبرية الصغيرة. وتكاد التجارب التي تتم في الأقفاص الصغيرة أن توفر قيما تجريبية تساعد على ملء تنفيذ التكنولوجيات الجديدة للقضاء على الملاريا. يمكن تكييف التجارب القفصية مع التصاميم التجريبية الأخرى وهي مناسبة لتقييم ديناميكيات تهديد الرغبة عبر الجينات.

بعد إدخال الأفراد المعدلة وراثيا. ابدأ المرحلة الأولى من التجربة من خلال إنشاء ثلاثة أقفاص 0.216 متر مكعب في ثلاث نسخ. وإضافة 60 يرقات من النوع البري الثاني إلى كل قفص على مدى ثلاثة أسابيع متتالية.

كل أسبوع، وتزويد الإناث البالغات في كل قفص مع الفئران تخدير كمصدر وجبة الدم. وحاوية oviposition بعد ثلاثة أيام من وجبة الدم. يفقس البيض من كل قفص أسبوعيا.

من الأسبوع الرابع إلى الثامن ، اختر 60 يرقة L2 الثانية في شكل عشوائي للعودة إلى أقفاصها الخاصة. في الأسبوع التاسع، تعيين عشوائيا مجموعة واحدة من أقفاص ثلاثية كعناصر تحكم ومجموعة واحدة لكل نسبة الإصدار المطلوب. إضافة 60 نوع البرية الخوادر مع 30 من الذكور و 30 الإناث إلى أقفاص التحكم أسبوعيا.

الحفاظ على نسبة واحدة إلى واحدة في كل قفص كل منها عن طريق إضافة أسبوعيا 30 الخوخ الذكور المعدلة وراثيا جنبا إلى جنب مع 60 نوع البرية pupae. لنسبة 1 إلى 0.1، إضافة 300 الخوخ الذكور المعدلة وراثيا أسبوعيا في كل قفص كل منها جنبا إلى جنب مع 60 نوع البرية الخوخ. كرر إضافة بعوضة في القفص ، وتوفير وجبة الدم وتفقيس البيض كل أسبوع.

اختر ما مجموعه 300 يرقة من كل قفص عشوائيا لفحصها. فحص اليرقات تحت مجهر ستيريو مع مرشحات مضان للتعبير عن علامة الفلورسنت المهيمنة في مراحل اليرقات والجراء. تسجيل جنس الخوادر الناتجة.

في تجربة محرك الجينات ، استخدم استراتيجية حاجز من خلال الحفاظ على البعوض في حشرة آمنة واتباع إجراءات التشغيل القياسية مع المراقبة المنتظمة. إعداد قفص إعداد مع مجموعتين من ثلاثة أقفاص 0.216 متر مكعب لكل المعدلة وراثيا المطلوب إلى البرية نوع نسبة إطلاق سراح الذكور. لتحقيق نسبة إطلاق الذكور من واحد إلى واحد، إضافة 120 الذكور المعدلة وراثيا، 120 نوع البرية الذكور والإناث في مرحلة الخوادر إلى كل قفص تكرار.

تقديم وجبة دم باستخدام الفئران تخدير إلى أربعة إلى سبعة أيام الإناث القديمة في كل قفص. بعد تفقيس البيض في صينية يرقية ، حدد ما يقرب من 240 يرقات نجمة L1 الأولى عشوائيا من كل قفص وتربيتها على الخوادر قبل العودة إلى أقفاصها. حدد وشاشة اليرقات لعلامة العين والنمط الظاهري الجنسي كما هو موضح من قبل.

تجميع إعداد قفص من ثلاثة أقفاص 0.005 متر مكعب مع عدد متساو من الذكور والإناث لكل نسبة إطلاق محددة من المعدلات وراثيا إلى الذكور نوع البرية. باستخدام جهاز التغذية الاصطناعية، وتوفير وجبات الدم للإناث من أربعة إلى سبعة أيام من العمر في كل قفص على يومين متتاليين. بعد ثلاثة أيام من وجبة الدم الثانية، أضف حاوية oviposition وأزل الحاويات بعد ثلاثة أيام.

بعد تسجيل جميع القتلى والبالغين الأحياء المتبقين في القفص عن طريق الجنس ، وتخزينها في ناقص 80 درجة مئوية للتحليل الجزيئي. يفقس البيض وتشغيل حدد 200 L1 اليرقات ووضع اليرقات جانبا لملء أقفاص جديدة للجيل القادم. ثم حدد عشوائيا 500 يرقة أخرى من كل قفص مخصص للفحص.

إعادة 200 يرقة مختارة إلى جروة و 500 يرقة إلى مرحلة L4 instar. عودة الخوخ من 200 الصواني لملء قفص جديد. شاشة اليرقات المختارة عشوائيا لعلامة العين والنمط الظاهري الجنسي كما كان من قبل.

في التحليل التمثيلي، يتم عرض الديناميكيات الظاهرية المتوقعة لأفضل النسخ المتماثلة أداء لبروتوكولات تجارب الأقفاص البديلة المختلفة للسكان. وأظهرت النتائج النسبة الخطية المتزايدة من اليرقات ذات النمط الظاهري لعلامة DsRed على مدى سبعة أجيال. وصل الإصدار غير الدافع إلى واحد إلى أكثر قليلا من 80٪ مقدمة متحولة في غضون سبعة أجيال.

وقد حققت بروتوكولات محرك الجينات ذلك في غضون ثلاثة إلى أربعة أجيال. وبالتالي التحقق من أن إصدار واحد من نظام محرك الجينات يمكن أن يكون أكثر كفاءة لإدخال المتحولين جنسيا. وفي نهاية الملاحظة، وصل انتشار الجين المتحول إلى مقدمة شبه كاملة في نظم محركات الجينات.

ستختلف المعلمات الهامة، مثل نسبة الإفراج عن بنية العمر السكاني، وحجم القفص، وغيرها وفقا لغرض التجربة وأهداف محددة. يمكن إجراء تجارب لتقييم معلمات اللياقة البدنية مثل الخصوبة والبراز. ويمكن استخدام المزيد من البيانات التجريبية من التجارب القفصية لتحديد النماذج الرياضية لديناميات السكان.