الكشف المباشر عن الأيزوليفوغلاندين في الأنسجة باستخدام بروتين اندماج الفوسفاتيز القلوي D11 scFv والتألق المناعي

وقد تورطت Isolevuglandins في العديد من الأمراض ، وخاصة أمراض القلب والأوعية الدموية. تم تطوير هذا البروتوكول للكشف عن isolevuglandins في الأنسجة مع بروتين اندماج الفوسفاتيز القلوي D11 ، والتألق المناعي. طرق الكشف الحالية باهظة الثمن أو تتطلب جسما مضادا ثانويا للعلامة الإلكترونية.

من الصعب العثور على جسم مضاد ثانوي موثوق به ، لكن هذا البروتوكول يزيل خطوة الأجسام المضادة الثانوية. اغمر شرائح الفئران والأنسجة البشرية المضمنة في البارافين في الزيلين ثلاث مرات لمدة خمس دقائق لإزالة الأنسجة. لإعادة ترطيب الأنسجة ، اغسل الأنسجة مرتين بنسبة 95٪ إيثانول ، متبوعا بغسلتين بنسبة 70٪ إيثانول ثم مرتين ب 50٪ إيثانول محضر في الماء.

اغسل الشرائح في محلول ملحي مخزن بنسبة 0.1٪ توين 20 ثلاث مرات عن طريق ملء حامل الشريحة ب TBST. ثم تجاهل TBST. ضع الشرائح في محلول سترات الصوديوم المسخن مسبقا واحتضانها في قدر ضغط مضبوط على أربع دقائق على ضغط عال ، لمدة 20 دقيقة لاسترجاع المستضد.

في نهاية الحضانة ، قم بإزالة الشرائح من قدر الضغط واتركها لتبرد لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. أعط ثلاث غسلات سريعة للشرائح باستخدام TBST كما هو موضح. قم بحظر الشرائح عن طريق إضافة 2٪ BSA مذابة في TBST.

غطي الشرائح بشريط البارافين واحتضانها في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة. بعد الحضانة ، تجاهل المخزن المؤقت للحظر. أضف 200 ميكرولتر من الفوسفاتيز القلوي D11 المحضر في TBST إلى الشرائح وقم بتغطية الشرائح بشريط البارافين.

بعد احتضان الشرائح في غرفة مرطبة لمدة ثلاث ساعات في درجة حرارة الغرفة ، اغسل الشرائح ثلاث مرات باستخدام TBST. قم بتطوير الشرائح باستخدام مطور الفوسفاتيز القلوي المسعر للكيمياء الهيستولوجية المناعية ، أو مطور الفوسفاتيز القلوي الفلوري للتألق المناعي. اغسل الشرائح مرة واحدة باستخدام TBST لإزالة المطور الزائد ومنع المزيد من تطوير الألوان.

قم بتلطيخ الشرائح بميكروغرام واحد لكل مليلتر من البقع النووية السداسية المحضرة في برنامج تلفزيوني للتألق المناعي. ثم اغسل الشرائح مرة واحدة باستخدام TBST لإزالة أي بقع مضادة زائدة. استخدم وسيط التثبيت لوضع انزلاق الغطاء على الشرائح المطورة.

راقب الشرائح تحت مجهر ضوئي مقلوب للكيمياء الهيستولوجية المناعية ، أو مجهر فلوري متحد البؤر للتألق المناعي. يمكن إجراء أربع تجارب تحكم سلبية لتأكيد خصوصية تلطيخ D11 AP ل isolevuglandin. في تجربة التحكم السلبية الأولى ، احتضان الأنسجة مع D11 AP المخفف في TBST ، أو TBST وحده.

ثم احتضان الأنسجة مع D11 AP المخفف واستخراج pariplasmic البكتيرية المخففة في TBST دون رابط D11 AP. بالنسبة للفحص التنافسي ، قم بإعداد isoLG و isoLG المضافين إلى ألبومين مصل الماوس بنسبة مولية من ثمانية إلى واحد. تمييع D11 AP واحد إلى 10 في TBST.

ثم احتضان D11 AP المخفف مع 50 ميكروغرام لكل مليلتر من MSA المقترب من isolevuglandin ، أو MSA غير المقرب لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة. أضف D11 AP مع isolevuglandin MSA أو D11 AP مع MSA غير المقرب إلى الأنسجة للتلطيخ. استخدم الجسم المضاد المتغير لجزء واحد السلسلة D20 لتلطيخ الأنسجة لمجموعة التحكم السلبية النهائية.

تمت دراسة التألق المناعي للشريان الأورطي في الفئران المصابة بارتفاع ضغط الدم وضغط الدم باستخدام هذا البروتوكول. أشار التلوين باستخدام D11 AP إلى زيادة تركيز isoLGs في الشريان الأورطي للفئران المصابة بارتفاع ضغط الدم الناجم عن الأنجيوتنسين II مقارنة بالفئران الضابطة. تم استخدام D11 AP للكشف عن isolevuglandins الموجودة في الأنسجة المعوية للمرضى البشريين الذين يعانون من ارتفاع ضغط الدم والبشر العاديين.

كان لدى الأنسجة من المرضى الذين يعانون من ارتفاع ضغط الدم تركيزات مرتفعة من isolevuglandins. كانت الأنسجة ملطخة بمستخلص pariplasmic وبدون D11 AP. لوحظ تلطيخ أكثر إشراقا في الأنسجة الملطخة ب D11 AP مقارنة بالأنسجة الملطخة بالمستخلص البلازمي ، مما يؤكد أن التلوين لم يكن بسبب الفوسفاتيز القلوي البكتيري غير المترافق الموجود في مستخلص pariplasmic. في الفحص التنافسي ، أظهرت الأنسجة الملطخة ب D11 AP المحتضنة مسبقا مع منافس isoLG تلطيخا متناقصا ، على غرار التلوين الذي لوحظ في الأنسجة مع D11 AP ، والذي يظهر خصوصية D11 AP إلى isolevuglandins.

في السيطرة السلبية ، أدى تلطيخ الشريان الأورطي للفأر باستخدام D11 AP إلى تلطيخ قوي مقارنة ب D20 ، مما يشير إلى خصوصية D11 AP إلى isolevuglandins في الشريان الأورطي لارتفاع ضغط الدم. من المهم تعطيل أي فوسفاتيز قلوي داخلي المنشأ موجود في الأنسجة للحد من تلطيخ الخلفية.