ثنائي الفينيل متعدد الكلور الرقمي القطيرات للكشف عن طفرات Indels في مجموعات البعوض Anopheline المعدلة وراثيا
يونيو 28, 2021
يوفر هذا البروتوكول الخطوات من استخراج الحمض النووي إلى الإعداد التجريبي ل PCR القطيرات الرقمية (ddPCR) ، بما في ذلك تحليل لتحديد وتحديد كمي لأحداث الانضمام النهائي غير المتجانسة (NHEJ) في المواقع المستهدفة بعد انشقاق Cas9 الناجم عن الحمض النووي الريبي وإصلاح الحمض النووي. وتشمل الاستخدامات الأخرى لهذه الطريقة تطبيقات مثل الكشف عن تعدد الأشكال والتحقق من متغير تحرير الجينات.
يوفر هذا البروتوكول سعة عالية وتركيبة موثوقة لتحليل NHEJ التي يمكن أن تحدد انتشار وكمية نسبية من طفرات Indel في مجموعات البعوض المحررة جينيا. بالمقارنة مع الجيل القادم، أو تسلسل سانجر، ddPCR لديه وقت تحول أسرع للنتائج، والذي يسمح بتحليل سريع وكامل للتنوع الجيني لحقل للكائنات المعدلة وراثيا. وينبغي أن تنطبق هذه الطريقة عموما على جميع النظم التجريبية.
وسوف يكون إثبات الإجراء التايلاندي فام، وهو باحث مشارك من مختبر يانغ. في البداية، قم بإعداد 25 ميكرولتر من ثنائي الفينيل متعدد الكلور الرقمي، أو مزيج عينة ddPCR عن طريق إضافة مزيج سوبر ddPCR، والتمهيدات الأمامية والعكسية، ومسابير HEX أو FAM، والحمض النووي والماء بالنسب الموصوفة في النص. ثم تخلط تماما رد الفعل عن طريق الدوامة.
باستخدام ماصة متعددة القنوات 50 ميكرولتر، قم بتحميل 20 ميكرولتر من مزيج عينات ddPCR في الصف الأوسط من الخرطوشة. ثم استخدم ماصة متعددة القنوات 200 ميكرولتر لتحميل 70 ميكرولتر من الزيت في الصف السفلي دون توليد فقاعات في جميع أنحاء ماصة. ضع طوقا، لمس الحواف فقط، وتجنب المركز، منطقة مقعرة، ومن ثم وضع لوحة بشكل آمن في مولد قطرة، وإغلاق الغطاء لبدء تشغيل.
لنقل مزيج الغمر من الصف العلوي من الخرطوشة إلى لوحة 96 بئرا، استخدم ماصة متعددة القنوات، وأسقط 40 ميكرولتر من العينة السائلة لمدة ثلاث إلى خمس ثوان بزاوية تتراوح بين 30 و45 درجة. ثم طرد الخليط في البئر ببطء لأكثر من ثلاث ثوان بزاوية 45 درجة، مما يسمح لها بالانسدل من الجانب، ومن ثم انتقل إلى المحطة الثانية من المصصة لطرد السائل تماما. باستخدام الأختام الحرارة احباط، ختم لوحات لمدة خمس ثوان في 180 درجة مئوية.
ضع اللوحة المغلقة في دراجة حرارية، وحدد شروط PCR لإرشادات إسقاط NHEJ عن طريق تعيين التشبع الأولي عند 95 درجة مئوية لمدة 10 دقائق. ثم، تعيين 40 دورات من 94 درجة مئوية لمدة 30 ثانية ل denature، 55 درجة مئوية من دقيقة واحدة إلى آنال، و 60 درجة مئوية لمدة دقيقتين لتمديد. بعد 40 دورة، تعيين عقد في 98 درجة مئوية لمدة 10 دقائق، وعقد النهائي في أربع درجات مئوية.
استخدم معدل منحدر درجتين مئويتين في الثانية لكل الخطوات. سوف تختلف درجة حرارة التلين، وفقا للمسابير أو التمهيدي المستخدمة. ضع اللوحة بشكل آمن في قارئ القطرات مع A1 المسمى جيدا في أعلى اليسار.
افتح البرنامج و قم بإعداد اللوحة عن طريق تعيين FAM كقناة مرجعية معروفة، و HEX كالقناة المجهولة لكل بئر. ثم قم بتغيير الاسم لكل عينة. تشغيل تجربة قراءة القطيرات كمكم مباشر أثناء حفظ القالب.
تعيين المعلمات التجريبية الصحيحة لتحليل البرامج ، وهي عينة من المعلومات ، والمزيج الفائق ، واسم الهدف ، ونوع الهدف ، وقناة الإشارة الأولى والقناة الثانية. ثم، تعيين عتبة لعدد قطرات فوق 10،000 للحصول على نتائج موثوق بها. بعد ذلك ، تحقق من عدد القطرات لكل بئر في علامة التبويب القطيرات ، مما يضمن أن جميعها فوق 10،000.
وأخيرا، تحقق من السعة 1D لفصل الإشارات الفعال عن السلبيات. في محرر اللوحة، قم بتمييز اللوحة بأكملها، ثم قم بتعيين نوع التجربة للإنزال. تعيين هدف WT كمرجع، تعيين القناة الأولى ل FAM والقناة الثانية ل HEX.
تعيين NHEJ الهدف كما غير معروف، تعيين القناة الأولى لFAM والقناة الثانية كما لا شيء. في علامة التبويب السعة 2D، تعيين عتبات الكتلة باستخدام أدوات الرسم البياني لكل عينة. ويرتبط الذيل عادة مع الكتلة WT لNHEJ المقايسات.
تحت علامة التبويب نسبة، انقر على رمز العتاد من أعلى يمين الرسم البياني، وحدد وفرة كسور لرسم نقطة المقابلة للنسبة المئوية للأحداث NHEJ. 15 عينات مختلفة سحبت من 10 البعوض كل تحتوي على مختلف الأليل NHEJ، تم تحليلها وتحديدها باستخدام المقايسة قطرة، وأظهرت النتائج أن جميع العينات 15 حملت 100٪ Indel أليليس. وفي تجربة أخرى، تم فحص 11 عينة من البعوض البري وبعوض NHEJ بنسب مئوية مختلفة من NHEJ مع بروتوكول ddPCR هذا.
وأظهرت النتائج أن النسبة المئوية المحددة كانت قريبة نسبيا من الكشف عن Indel عن طريق تقنية تحليل amplicon. ماصة ببطء لتجنب الفقاعات، والسماح لجميع قطرات مستحلب بالتنقيط أسفل جدار الآبار.
نظرة عامة
يحدد هذا البروتوكول الخطوات اللازمة لتفاعل البوليمراز المتسلسل الرقمي بتقنية النقاط المائية (ddPCR) لتحليل أحداث الانضمام غير المتجانسة (NHEJ) التي تتبع عملية انقسام Cas9. يوفر طريقة موثوقة لتحديد كمية طفرات Indel في الكائنات المعدلة وراثيًا.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلم
- الهندسة الوراثية
- علم الأحياء الجزيئي
- علم الجينوم
الخلفية
- NHEJ هو آلية إصلاح حاسمة للحمض النووي.
- ddPCR يقدم مزايا على طرق التسلسل التقليدية.
- التحليل السريع ضروري للتطبيقات الميدانية في التعديل الوراثي.
- يمكن تطبيق هذه الطريقة عبر أنظمة تجريبية مختلفة.
غرض الدراسة
- لتوفير بروتوكول مفصل لتحليل أحداث NHEJ باستخدام ddPCR.
- لتسهيل تحديد كمية التغيرات الوراثية في الكائنات المعدلة.
- لإظهار فعالية ddPCR في تحديد طفرات Indel.
الطرق المستخدمة
- تحضير مزيج عينة ddPCR مع كواشف محددة.
- تحميل العينات في مولد النقاط المائية والثيرموسايكلر.
- إعداد شروط PCR لتحليل NHEJ.
- استخدام برامج لقراءة النقاط المائية وتحليل البيانات.
النتائج الرئيسية
- أظهرت جميع العينات التي تم تحليلها 100٪ من أليلات Indel.
- كانت نتائج ddPCR قابلة للمقارنة بتقنيات تحليل المضخم.
- تم تحقيق تحديد كمي موثوق لأحداث NHEJ.
- أظهرت الطريقة كفاءة في تحليل التنوع الجيني.
الاستنتاجات
- ddPCR هو أداة قوية لتحليل أحداث NHEJ.
- يمكن تكييف البروتوكول لدراسات جينية مختلفة.
- يعزز وقت التنفيذ السريع من قدرات البحث في علم الوراثة.
الأسئلة الشائعة
Executive Industry Relevance
Digital-droplet PCR (ddPCR) enables rapid, quantitative detection of indel mutations in genetically modified mosquito populations, supporting high-throughput assessment of CRISPR-Cas9 editing fidelity. This method provides a field-deployable alternative to sequencing with faster turnaround, facilitating timely decision-making in gene drive and vector control programs. By delivering population-level mutation frequency data, ddPCR aids in de-risking genetic constructs and evaluating off-target potential during preclinical development.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Quantifies indel mutation prevalence to assess CRISPR-Cas9 editing efficiency and mutagenesis consistency in target genomes.
- Operational Value: Enables rapid screening of edited mosquito pools to confirm on-target activity before advancing to functional assays.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative NHEJ event data without requiring individual sequence identification, supporting scalable mutation burden assessment.
- Operational Value: Compatible with field-site laboratory implementation, reducing dependency on centralized sequencing infrastructure.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Measures indel allele frequency across pooled samples to correlate genetic variation with phenotypic outcomes in gene drive systems.
- Operational Value: Delivers results faster than Sanger or next-generation sequencing, accelerating iteration cycles in preclinical validation.
Pipeline & Workflow Integration
ddPCR fits into the discovery continuum by enabling quantitative mutation analysis after gene editing and before phenotypic screening, supporting go/no-go decisions based on editing precision.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by quantifying NHEJ-derived indels as a proxy for editing efficiency at target loci.
- Screening: Provides standardized, reproducible quantification of mutation frequency across large sample sets for assay readiness.
- Analytics: Outputs fractional abundance of NHEJ events, allowing comparison of editing conditions and guide RNA performance.
- Translational Research: Enables continuity from edited construct validation to population-level genetic stability assessment.
- Enterprise Reuse: Protocol is adaptable across insect and other model systems for consistent NHEJ analysis in genetic engineering workflows.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in editing fidelity through quantitative indel detection, reducing mechanistic ambiguity in gene-edited systems.
- Operational Value: High-throughput capability with minimal hands-on time and rapid results, improving lab throughput.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions by establishing mutation frequency thresholds, reducing late-stage failure risk.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of gene drive constructs based on validated editing precision.
Implementation Considerations
- Requires expertise in ddPCR setup, including sample preparation, droplet generation, and PCR optimization.
- Dependent on access to droplet generator, thermocycler, and fluorescence reader with appropriate channel configuration.
- Necessitates standardized primer and probe design for accurate target discrimination in NHEJ assays.
- Must account for variability in annealing temperature based on probe chemistry to ensure signal separation.
- Limited to relative quantification; does not provide allele-specific sequence information without complementary methods.
![ترنسفكأيشن والطفرات في الجينات المستهدفة في الخلايا عن طريق البعوض مغلق [أليغنوكليوتيد] حمض تعديل الأحماض النووية](/_next/image?url=https%3A%2F%2Fcloudfront.jove.com%2FCDNSource%2Fteasers%2F2355.jpg%3Fv%3D2026-07-07T11%253A36%253A56.902Z&w=384&q=75)
