تبادل الهيدروجين / الديوتيريوم القائم على الرحلان الكهربائي الشعري للتوصيف التوافقي للبروتينات باستخدام مطياف الكتلة من أعلى إلى أسفل
يونيو 8, 2021
يظهر هنا بروتوكول لنهج تبادل الهيدروجين / الديوتيريوم (HDX) القائم على الرحلان الكهربائي الشعري إلى جانب قياس الطيف الكتلي من أعلى إلى أسفل. يميز هذا النهج الفرق في الهياكل ذات الترتيب الأعلى بين أنواع البروتين المختلفة ، بما في ذلك البروتينات في حالات مختلفة وأشكال بروتينية مختلفة ، من خلال إجراء فصل HDX التفاضلي المتزامن والفصل الكهربائي.
تسمح هذه الطريقة بفصل أنواع البروتين المتعايشة ، بما في ذلك المطابقات أو المتغيرات المختلفة والتوصيف عبر الإنترنت لاختلافات هيكلها الأعلى ترتيبا ليتم إكمالها في قياس CEMS واحد. وهو يستخدم التأثير الكهربائي لتوفير بيئة مدتها 100٪ تقريبا لتفاعلات HDX والفصل المتعامد لأنواع البروتين المتعايشة أثناء HDX لتحليل MS من أعلى إلى أسفل. ابدأ بالتكييف المسبق للرحلان الكهربائي الشعري أو تبادل الديوتيريوم الهيدروجيني أو إعداد CE HDX.
باستخدام الموجات فوق الصوتية في خليط من 50٪ ميثانول و 49٪ ماء و 1٪ حمض الفورميك ، قم بتنظيف التدفق من خلال واجهة CE-MS الدقيقة لمدة 30 دقيقة على الأقل في درجة حرارة الغرفة. قم بتركيب الشعيرات الدموية المعدلة HPC على أداة الكهربية الشعرية أو أداة CE. شطف الشعيرات الدموية بمحلول إلكتروليت الخلفية أو BGE لمدة 10 دقائق باستخدام جهاز أخذ العينات التلقائي واتركه ممتلئا ب BGE.
استخدم طولا مناسبا من أنابيب الشعيرات الدموية غير المنصهرة غير المعدلة كأنابيب ضخ لمحلول المعدل. استخدم اتحادا وأكماما مناسبة لتوصيل أنبوب المعدل بحقنة زجاجية محكمة الإغلاق تعمل بالغاز مع درجة حرارة حادة وشطف الأنابيب بمحلول المعدل لمدة 10 دقائق على الأقل باستخدام مضخة تسريب. أدخل منافذ أنابيب CE الشعرية والمعدلة المشفرة من HPC المحملة بالحلول المقابلة في واجهة CE-MS التي تم تنظيفها.
تقدم المحقنة باستخدام مضخات التسريب بحيث يصل محلول المعدل إلى طرف الواجهة. قم بتركيب واجهة CE-MS المجمعة على مصدر تأين رذاذ الإلكترون النانوي لمقياس الطيف الكتلي. قم بتطبيق جهد رذاذ من 3-5 كيلوفولت على واجهة CE-MS.
قم ببث محلول المعدل مع مضخة المنقوع بمعدل تدفق يتراوح بين 0.1-10 ميكرولتر في الدقيقة وتأكد من وجود رذاذ كهربائي مستقر عند طرف واجهة CE-MS. ضع قارورة العينة التي تحتوي على BGE وجهاز أخذ العينات التلقائي ، والتي سيتم استخدامها لاحقا للحصول على الكهروفيروجات الكهربائية الفارغة وأطياف الكتلة الفارغة. تقدير حجم الحقن باستخدام العلاقة بين حجم الحقن ومعلمات الحقن.
وحقن محلول العينة باستخدام جهاز أخذ العينات التلقائي في اثنين من PSI لمدة مناسبة. ابدأ فصل CE عن طريق تطبيق جهد كهربائي يبلغ 20 كيلوفولت في ضغط تسريب يتراوح من 0-2 رطل لكل بوصة مربعة والحصول على مخطط كهربائي. وفي الوقت نفسه ، احصل على بيانات MS في الوضع الكروماتوغرافي حيث يتم الحصول على الرسم البياني للتيار الأيوني كدالة للوقت ولا يتم دمج عمليات مسح MS المقابلة تلقائيا في طيف واحد.
احفظ مخطط الفيروغرام الكهربائي الفارغ وأطياف الكتلة كمراجع. ضع قوارير العينة التي تحتوي على التركيزات المطلوبة من محاليل عينات البروتين في جهاز أخذ العينات التلقائي واحصل على أطياف الكهربية و MS1 لأنواع البروتين المنفصلة كهربائيا والديوتيريوم. قم بإجراء قياسات Ms.Measurements جنبا إلى جنب للأنواع ذات الأهمية ، إما بعد الحصول على أطياف MS1 داخل نفس التشغيل أو في تشغيل منفصل لاحق.
بعد كل قياس، اغسل الشعيرات الدموية باستخدام BGE عند ضغط 20 رطل لكل بوصة مربعة لمدة 10 دقائق على الأقل. تنظيف واجهة CEMS وجميع الأنابيب للتخزين عند الانتهاء من التجارب. احصل على مجموعة بيانات من عينة نقطة نهاية HDX باستخدام MS في وضع التسريب المباشر.
أدى انخفاض ضغط التسريب إلى فصل أفضل لقمم CE ، ولكنه أدى إلى زيادة في كل من وقت الهجرة ومدة التجربة. أدى وقت تفاعل HDX الأطول إلى مستوى أعلى من انخفاض مدة تحليلات البروتين. أدى التباين A و B في الغلوبولين المناعي بيتا أو بيتا IG ، اللذان يختلفان باثنين فقط من بقايا الأحماض الأمينية في تسلسلهما ، إلى ظهور قمتين منفصلتين بشكل كاف في مخطط الكهربية المشتق من EIC.
أدى التباين التفاضلي المسمى بالديوتيريوم إلى توزيع كتلة متميزة للأيونات. وقد لوحظ وجود عدد أقل في الوفرة النسبية لأيونات Z من أيونات C بسبب الارتباط الفريد غير المستقر في تأكيد بيتا IG الذي يحد من كفاءة التجزئة بين CS 82 و CS 176. تظهر معظم أيونات الشظايا المنتجة من بيتا IGA ، وبيتا IGB مدى مماثل من امتصاص الديوتيريوم.
ومع ذلك ، تم تخفيض الأجزاء الأكبر التي تغطي مواقع تباين التسلسل من بيتا IGA إلى حد أكبر بكثير من بيتا IGB. يتم ضبط الرقم الهيدروجيني ل BGE وفقا للنقطة المتساوية الكهربية للعينة لمنع تراكم البروتين وتسهيل الفصل مع الحفاظ على المجمع.
اعرض النص الكامل واحصل على الوصول إلى آلاف الفيديوهات العلمية
نظرة عامة
يوضح هذا البروتوكول طريقة لتبادل الهيدروجين/الديوتيريوم (HDX) تعتمد على الفصل الكهربائي الشعري مدمجة مع قياس الطيف الكتلي من الأعلى إلى الأسفل (top-down mass spectrometry). وتسمح هذه الطريقة بتوصيف الاختلافات في البنية عالية الرتبة بين أنواع مختلفة من البروتينات، بما في ذلك الحالات والأشكال البروتينية المختلفة، من خلال التبادل التفاضلي المتزامن لـ HDX والفصل الكهربائي.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلم
- الكيمياء الحيوية
- مطيافية الكتلة
- كيمياء البروتين
خلفية علمية
- يُعد الفصل الكهربائي الشعيري (CE) تقنية قوية لفصل الجزيئات الحيوية.
- يوفر تبادل الهيدروجين/الديوتيريوم (HDX) رؤى حول ديناميكيات البروتين وبنيته.
- يتيح مطياف الكتلة من الأعلى إلى الأسفل (Top-down mass spectrometry) تحليل البروتينات السليمة ومتغيراتها.
- يمكن لهذه الطريقة تحليل عدة تشكلات بروتينية في قياس واحد.
الغرض من الدراسة
- تطوير طريقة لتحليل البنى ذات الرتب العليا للبروتينات.
- تسهيل عملية فصل أنواع البروتينات الموجودة معاً.
- تعزيز كفاءة قياسات HDX من خلال الفصل الكهربائي.
الطرق المستخدمة
- تهيئ إعدادات الفصل الكهربائي الشعيري.
- المعالجة بالموجات فوق الصوتية لواجهة CE-MS في مزيج من الميثانول والماء وحمض الفورميك.
- شطف الشعيرة بمحلول الإلكتروليت الخلفي.
- إجراء تفاعلات HDX في بيئة محكومة أثناء الفصل الكهربائي.
النتائج الرئيسية
- الفصل الناجح للمتشكلات البروتينية المختلفة.
- توصيف الاختلافات الهيكلية في قياس واحد بواسطة CEMS.
- إثبات كفاءة الطريقة للتحليل المباشر (online analysis).
- تقديم رؤى حول ديناميكيات الأنواع البروتينية.
الاستنتاجات
- تعد طريقة CE HDX فعالة لدراسة بنية البروتين.
- يمكن تطبيق هذا النهج على أنواع وحالات بروتينية مختلفة.
- توفر هذه الطريقة عملية مبسطة لتحليل ديناميكيات البروتين.
الأسئلة الشائعة
الأهمية التنفيذية للصناعة
لا يزال حل مشكلة التباين التشكيلي للعلاجات البروتينية يمثل تحدياً حرجاً في مجال البحث والتطوير في الصناعات الدوائية الحيوية، لا سيما عند توصيف البنى عالية الرتبة وديناميكيات حالات البروتين المتعايشة. تتيح هذه الطريقة القائمة على التبادل الهيدروجيني/الديوتيري بالرحلان الكهربائي الشعري (CE-HDX) تحليلاً محدداً للمتشكلات للفروق البنيوية للبروتين في قياس واحد، مما يدعم التحقق من الهدف والحد من المخاطر الميكانيكية في مراحل الاكتشاف المبكرة. ومن خلال دمج الفصل الرحلاني الكهربائي مع مطيافية الكتلة من الأعلى إلى الأسفل (top-down MS)، يعزز هذا النهج الثقة التنبؤية في سلوك البروتين ويوجه قرارات المضي قدماً أو التوقف أثناء عملية تحديد المركبات الرائدة.
التطبيقات الاستراتيجية في البحث والتطوير في مجال الأدوية البيولوجية
الاكتشاف المبكر والتحقق من الهدف
- القيمة العلمية: تتيح استقصاء الفرضيات العلاجية من خلال تحديد الاختلافات التشكلية بين متغيرات البروتين والأشكال البروتينية (proteoforms).
- القيمة التشغيلية: تدعم التحقق من صحة الأهداف الوظيفية من خلال توصيف البنية عالية الرتبة الخاصة بالتشكلات.
- القيمة التنبؤية: تعزز الثقة في اختيار الهدف عن طريق الكشف عن الديناميكيات الهيكلية ذات الصلة بالوظيفة البيولوجية.
الفحص وتطوير المقايسة
- جاهزية المقايسة: تهيئة الأنظمة البروتينية ذات الصلة بيولوجياً لعمليات الفحص اللاحقة من خلال فصل وتوصيف الحالات المتعايشة.
- المخرجات الكمية: توفير قياسات الديوترية على المستوى الشامل ومستوى الشظايا، مما يتيح المقارنة الكمية بين المتشكّلات البروتينية.
- قابلية التكرار: تقليل المذيب البروتوني المتبقي أثناء عملية HDX، مما يخلق بيئة ديوترية شبه كاملة لضمان اتساق النتائج.
الأبحاث الانتقالية وما قبل السريرية
- الاستمرارية الترجمية: تربط الرؤى التشكيلية في مرحلة الاكتشاف بالتحقق قبل السريري من خلال توصيف ديناميكيات البروتين في المحلول.
- تقليل المخاطر الآلية: توضح العلاقات بين البنية والوظيفة في متغيرات البروتين، مما يقلل من الغموض في تحسين المركبات الرائدة.
- المواءمة مع المؤشرات الحيوية: تدعم تحديد المؤشرات الحيوية التشكيلية المرتبطة بالنتائج الوظيفية في الأنظمة ذات الصلة بالمرض.
تكامل مسار العمل وسير العمل
تندرج هذه الطريقة ضمن سلسلة عمليات الاكتشاف، بدءاً من التحقق المبكر من الهدف وصولاً إلى تحديد المركبات الرائدة، حيث يساهم تحديد البنية التشكلية في توجيه عمليات هندسة البروتين وحملات الفحص.
- بيولوجيا الاكتشاف: تدعم اختبار الفرضيات من خلال فصل وتحليل التشكلات البروتينية المتواجدة معاً في ظروف قريبة من الحالة الطبيعية.
- الفحص: تتيح توحيد المقاييس من خلال تقديم قراءات هيكلية كمية وقابلة للتكرار للأنواع البروتينية.
- التحليلات: توفر مستويات الديتيروم الشاملة وأنماط الامتصاص النوعية للشظايا التي تسهل التحليل المقارن لحالات البروتين.
- الأبحاث الانتقالية: تربط الديناميكيات الهيكلية بالنتائج الوظيفية، مما يدعم قرارات التطوير المعدلة حسب المخاطر.
- إعادة الاستخدام المؤسسي: تعمل كمنصة قابلة لإعادة الاستخدام لتوصيف عدم التجانس البروتيني عبر أهداف ومشاريع متعددة.
التأثير التشغيلي وعلى مستوى المؤسسة
- القيمة العلمية: تزيد من الثقة التنبؤية في سلوك البروتين من خلال حل التباين التشكيلي.
- القيمة التشغيلية: تعزز إمكانية التكرار والقابلية للتوسع من خلال التكامل الآلي بين CE-MS وتقليل الشوائب الناتجة عن المذيبات.
- القيمة الاستراتيجية: تحسن جودة قرارات المضي قدماً أو التوقف من خلال تقليل عدم اليقين الميكانيكي في البروتينات المستهدفة.
- التأثير على المحفظة: تتيح تحديد الأولويات للمرشحات البروتينية بناءً على الاستقرار الهيكلي والديناميكيات بعد تعديل المخاطر.
اعتبارات التنفيذ
- يتطلب خبرة في الفصل الكهربائي الشعري، ومطيافية الكتلة، ومبادئ التبادل الهيدروجيني للديوتيريوم (HDX) للبروتينات.
- يعتمد على توافق واجهة CE-MS، وتحسين الإلكتروليت الخلفي، وتوصيل محلول المعدل.
- يستلزم توحيد معايير إخماد HDX، والمسخ، ومعلمات الحصول على بيانات MS بين الفرق المختصة.
- يتضمن اعتبارات التكيف مع تباين حجم البروتين وشحنته وقابليته للذوبان تحت ظروف الفصل الكهربائي.
- يقتصر بسبب وقت التحليل عند ضغوط التسريب المنخفضة، والتي تحسن الفصل ولكنها تطيل مدة التجربة.
