تقييم النشاط المضاد للأورام في الجسم الحي للجسيمات النانوية Polyanhydride IL-1α

توفر هذه البروتوكولات طريقة فعالة لدراسة النشاط المضاد للأورام لهجمات المغير المناعي. علاوة على ذلك ، يمكن إجراء تحليل للفرص المرتبطة في السيتوكينات المنتشرة ومجموعات الخلايا المناعية باستخدام هذه الطرق المقترحة. الميزة الرئيسية لهذا البروتوكول هي أنه سهل وطريقة مباشرة لزرع الورم ومراقبة نموه. الآثار المباشرة لهذه التقنية هي تقييم فعالية بعض العلاجات أو التحديات في أبحاث مكافحة السرطان. بالإضافة إلى ذلك ، فإن بعض جوانب هذه التقنيات مناسبة لدراسات السمية. للبدء ، قم بإذابة قارورة مجمدة من خلايا EERL للفئران في حمام مائي مسخن مسبقا عند 37 درجة مئوية وانقلها إلى أنبوب مخروطي سعة 15 ملليلتر يحتوي على وسائط استزراع دافئة. جهاز طرد مركزي الأنبوب المخروطي عند 277 مرة G لمدة خمس دقائق عند 25 درجة مئوية لإزالة الوسائط. ثم أعد تعليق الحنك الخلوي في ثلاثة إلى خمسة ملليلتر من الوسائط الطازجة ونقله إلى قارورة زراعة الخلايا T25. دع الخلايا تنمو في حاضنة رطبة عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون ، توسع إلى قوارير أكبر ومرور كل ثلاثة أيام. عندما يكون هناك ما يكفي من الخلايا للزرع المطلوب في جميع الفئران ، قم بإزالة القوارير ، وتجاهل الوسائط وشطف الخلايا برفق PBS. ثم أضف أربعة ملليلتر من 0.25٪ تربسين EDTA واحتضانها عند 37 درجة مئوية لمدة دقيقتين. أضف وسائط جديدة لوقف تفاعل التربسين وجمع تعليق الخلية في أنابيب مخروطية سعة 50 ملليلتر. أعد تعليق الخلايا في وسائط جديدة وعد الخلايا. أجهزة الطرد المركزي مرة أخرى ، ثم أضف برنامج تلفزيوني بارد إلى الخلايا لعمل تركيز نهائي قدره 10 ملايين خلية لكل ملليلتر. الحفاظ على تعليق الخلية على الجليد قبل الحقن. تطهير منطقة الجناح مع وسادة الإيثانول. لحقن تعليق الخلية في الفئران ، قم بنضح 100 ميكرولتر من تعليق الخلية في المحقنة وإزالة جميع الفقاعات والمساحة الميتة من الأعلى. ثم حقن تعليق الخلية تحت الجلد بطريقة بطيئة وثابتة في الفئران المخدرة. ضع الحيوانات في أقفاصها وراقبها حتى تتعافى من التخدير. لجمع الدم ، أمسك الجلد المترهل على الكتف باستخدام اليد غير المهيمنة وثقب الوريد تحت الفك السفلي بإبرة أو إبرة قياس 18. اجمع 200 إلى 300 ميكرولتر من الدم في أنبوب طرد مركزي دقيق من مادة البولي بروبيلين سعة 1.5 ملليلتر أو أنبوب فاصل المصل. بعد جمع الدم ، اضغط برفق على موقع البزل حتى يتوقف النزيف. أعد الفئران إلى أقفاصها وراقبها حتى تتعافى من التخدير. دع الدم الذي تم جمعه يتجلط في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 إلى 30 دقيقة. ثم ضع الأنابيب على الثلج حتى تصبح جاهزة للطرد المركزي. أجهزة الطرد المركزي الدم المتخثر عند 1،540 مرة G لمدة 15 دقيقة عند أربع درجات مئوية ، وجمع بعناية طبقة المصل من الأعلى. قم بإذابة عينات المصل أو البلازما مع الاحتفاظ بها على الجليد. بعد ذلك ، قم بطرد العينات عند 1،540 مرة G لمدة خمس دقائق عند أربع درجات مئوية ، لترسيب أي حطام خلوي وجمع طبقة المصل بعناية من الأعلى. ضع مجموعة تعدد الإرسال في درجة حرارة الغرفة وقم بإجراء الفحص وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة. ضع كل فأر على ظهره ورش 70٪ إيثانول على جلد منطقة البطن. استخدم الملقط والمقص لقطع العقدة الليمفاوية من الجانب الأيمن من الفئران والورم من الجانب الأيسر. إذا كان الورم كبيرا ، فقم بتقطيعه إلى قطع صغيرة وإزالة حوالي 500 إلى 600 ملليغرام من الأنسجة. ضع الأنسجة على أنابيب التفكك المعنية التي تحتوي على ثلاثة إلى خمسة ملليلتر من وسائط RPMI. تجانس الأنسجة باستخدام جهاز فصل آلي. بعد التجانس ، قم بتصفية تعليق الخلية من خلال مرشح 70 ميكرومتر في أنبوب مخروطي 50 ملليلتر. أجهزة الطرد المركزي عند 277 مرة G لمدة خمس دقائق عند 25 درجة مئوية لإزالة الوسائط. اغسل الخلايا وأعد تعليقها في واحد إلى ملليلتر من برنامج تلفزيوني بارد. استخدم 0.4٪ تلطيخ أزرق من التربسين ، لحساب الخلايا القابلة للحياة في مقياس الدم.احسب الحجم المطلوب للحصول على مليونين إلى ثلاثة ملايين خلية ونقلها إلى أنبوب الفاكس المعني. أحصى جهاز الطرد المركزي الخلايا عند 277 مرة G لمدة خمس دقائق عند 25 درجة مئوية.صب المادة الطافية وإعادة تعليق الخلايا إلى 300 ميكرولتر من PBS. أضف 0.5 إلى ميكرولتر واحد من صبغة الزومبي لكل أنبوب واحتضانها في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة في الظلام. أجهزة الطرد المركزي للخلايا اغسلها بواحد إلى ملليلتر من المخزن المؤقت للفاكس وأعد تعليقها في 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت للفاكس. أضف مانع مستقبلات FC وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة واحتضان الخلايا لمدة 10 دقائق. أجهزة الطرد المركزي مرة أخرى في الإعدادات الموصوفة سابقا وغسل الخلايا مع واحد إلى اثنين ملليلتر من المخزن المؤقت للفاكس. أضف كوكتيل الأجسام المضادة واحتضانه لمدة 30 دقيقة عند أربع درجات مئوية في الظلام. بعد الحضانة ، أجهزة الطرد المركزي وغسل الخلايا مع واحد إلى اثنين ملليلتر الفاكس العازلة. أضف 300 إلى 400 ميكرولتر من محلول بارافورمالدهيد 2٪ ، وأعد التعليق للتثبيت. قم بتخزين الخلايا لبضعة أيام عند أربع درجات مئوية أو قم بتحليلها على الفور بواسطة مقياس التدفق الخلوي متعدد الألوان. في هذه الدراسة ، النشاط المضاد للأورام من polyannhydride IL-1