مجموعة أدوات تكاملية لتحليل الإشارات الخلوية: القوى والحركة والمورفولوجيا والفلورسينس

الخلايا الملتصقة تمارس قوات على محيطها، وتشمل تلك القوى الخلايا القوات التي تمارس على الركيزة، كما هو موضح هنا باللون الأخضر، والخلايا القوات تمارس على جيرانها، كما هو مبين باللون الأحمر. ويمكن قياس هذه القوى في monolayers الخلوية باستخدام تقنية تسمى المجهر الإجهاد أحادي الطبقة. باختصار ، تتضمن التقنية إعداد المواد الهلامية المائية التي تحتوي على حبات الفلورسنت الصغيرة ، أسفل السطح العلوي مباشرة ، والخرز الفلوري الكبير الذي يتم لصقه على الزجاج.

على هذا الهيدروجيل، يرى المرء الخلايا والثقافات لهم لالتقاء أو أيا كانت الدولة التي يرغب المرء في قياس القوى. يتطلب قياس القوى تصوير الطبقة الأحادية الخلوية ، والتقاط صور ضوئية مرسلة للخلايا ، وصور ضوئية فلورية للخرزات الصغيرة والكبيرة. يتم الحصول على كل من هذه الصور في نفس الطائرة الصوتية.

يتم الحصول على هذه الصور عندما يتم إرفاق الخلايا وفصلها عن الهيدروجيل. والمقارنة بين هاتين المجموعتين من الصور تزودنا بالبيانات اللازمة لقياس كل هذه القوى. هذا هو المكان الذي AcTrM و AnViM تأتي في اللعب.

بعد تشغيل الخلايا ، للحصول على صور في نفس الموقع بالضبط ، في أي مثيل مطلوب ، يتم برمجة هذا البروتوكول في AcTrM ثم لتحليل هذه البيانات لاحقا وتصور النتائج ، وهذا هو الغرض من AnViM. في الدقائق القليلة القادمة، سوف نسير لكم من خلال عملية الحصول على صور لخلية التقاء monolayer. الخطوة صفر الإجراء يطالب المستخدم لتحديد نوع الاستحواذ.

عملية استحواذ جديدة لبدء تجربة جديدة، أو اقتناء مستمر لاستئناف تجربة سابقة. انقر فوق اكتساب جديد لإنشاء قائمة موضع. تسرد الخطوة الأولى من الإجراء كل خطوتك التالية.

وسيتم اتخاذ هذه الإجراءات في نافذة قائمة موضع المرحلة هنا. انقر فوق Live في Micro-Manager لتصور العينة لإجراء تعديلات يدوية. في العرض المباشر ، سننظر في المرحلة.

هنا هو واضح. الآن ، سيحتاج المرء إلى إلقاء نظرة على الخرز. هنا، يمكن تصور الخرز في مضان.

لذا حدد القناة المناسبة للخرزات العلوية. من المهم أيضا أن تتمكن من رؤية بعض الخرز السفلي ، لذلك دعونا ننظر إلى قناة للخرزات السفلية. ما تراه هنا هو صورة ضبابية من الخرز السفلي ، وهذا جيد تماما طالما يمكنك معرفة أن الخرز السفلي موجود ، والذي يمكنك في هذه الصورة.

قائمة الموضع، انقر فوق علامة. هذه هي الطريقة التي تقوم بها بإنشاء قائمة المناصب. بعد إنشاء قائمة مراكز، والتي تمت مناقشتها في الفيديو السابق، اتبع الخطوات المدرجة في الخطوة الثانية من الإجراء باستخدام نافذة الاستحواذ متعددة الأبعاد.

لنفترض أننا نريد إجراء فاصل زمني طويل. هنا ، سأشير إلى عدد الصور التي نريد التقاطها. القناة الأولى ستكون قناة المرحلة.

التالي سيكون من الخرز العلوي والآخر بعد ذلك سيكون الخرز السفلي. انقر فوق إغلاق في إطار اقتناء متعدد الأبعاد ثم انقر فوق موافق في الخطوة الثانية AcTrM. سيتم حفظ الإخراج في الدليل المحدد في إطار اقتناء متعدد الأبعاد.

الخطوة الثالثة الإجراء سوف تسأل إذا كانت التجربة تحتاج إلى الانتعاش. الجواب سيكون عادة نعم. هنا iTACS يسأل، هل نريد أن أداء الانتعاش المكرر؟

هذا الجزء الأول هو الذهاب الى الحصول على لنا قريبة جدا من الانتعاش المكرر، ولكن الجزء السفلي هو الذهاب الى الحصول على لنا حتى أقرب إلى دقة أعلى من إعادة تحديد المواقع. إذا كان الاسترداد سيتم باستخدام مجال رؤية محدود، يتم تقديم هذا الخيار، ولكن لهذه التجربة، لن نقوم بتحديد هذا الخيار. عند هذه النقطة ، والحصول على مجموعة من الصور المرجعية كاملة ويمكن إغلاق مايكرو مدير.

للحصول على الصور ، سيبدأ المرء AcTrM. حدد التكبير واختر الدليل الذي يحتوي على مجلدات البيانات. حدد خيارات لتغيير موضع اللوحة مع القناة المستخدمة لتغيير الموضع.

يتم توفير واجهة لمطابقة ما يشاهد حاليا في الكاميرا مع الصور المحفوظة. إذا كان هناك تداخل، سيتم عرض الصور لون أحمر وأخضر جنبا إلى جنب مع الأسود، ويمكن إجراء التعديل اليدوي. وإلا، ضرب قبول، وسوف تستمر عملية الاستحواذ.

يمكننا الآن أن نبدأ فيجي. حدد الخيار الأول في القائمة المنسدلة MSM المسماة المعالجة المسبقة. ثم حدد المجلد الذي يحتوي على المجلد tnimgs.

بعد ذلك ، سيتعين علينا تحديد القناة التي تتوافق مع الصورة. على سبيل المثال، القناة 0 هي صورة الضوء المرسل وهي صورة تباين الطور للخلايا. صورة الخرزة السفلية هي القناة 2 ، وصورة الخرزة العلوية هي القناة 1.

وبعد ذلك، فإنه يطلب منك أين تعبر الخلايا وأي جانب من الصورة. في هذه الحالة، الخلايا هي أحادية الطبقة تتقدم نحو الحافة اليمنى لذلك سنقوم بإلغاء تحديد اليمين، والاستمرار. هنا منطقة صغيرة من الخرز العلوي ، وتقع بعيدا عن monolayer ، تخدم نفس الغرض من صور حبة القاع التي من شأنها أن تظهر sparser وأكبر من تلك المعروضة هنا.

الآن هو يسألنا ما إذا كنا نريد تغيير السطوع والتباين حتى الخرز تظهر بشكل بارز. لذلك نحن ضبط باستخدام أشرطة شريط التمرير في القائمة، وبمجرد أن تظهر الخرز بارزة انقر فوق موافق. والآن، سنقوم بتصحيح الموقف. إذا كان هناك أي تحول، فإنه سيتم التخلص منه.

وبعد الانتهاء من ذلك ، سيقوم بإنشاء مجلد التحليل. داخل مجلد التحليل ، سيقوم بإنشاء مجلد الموضع ، P0 ، ويتم تخزين الخيارات التي قمنا بها في قوائم ما قبل المعالجة السابقة في خيارات التحليل ، مثل الحواف التي تم عبورها ، وحجم البكسل ، والصورة التي هي تباين الطور وغيرها. في الفحص المجهري للإجهاد أحادي الطبقة ، أو القائمة المنسدلة MSM ، حدد تشوه هلام MSM.

من هنا ، سنحدد الخيار المناسب لتوزيع الخرز لدينا. وأثناء معالجة البيانات ، يمكنك أن ترى أن مجلد إزاحة جديد قد ظهر في مجلد الموضع. سيكون هذا هو المكان الذي سيتم فيه تخزين جميع ملفات الإخراج.

هذا يشير إلى أن التحليل قد اكتمل. سننظر في كيفية حساب القوى التي تمارس عبر تقاطع الخلية ECM ووصلة الخلية الخلوية وكذلك الهيكل الخلوي للخلايا الفردية للطبقة الواحدة. لذلك، حدد الخيار الثالث.

واحد هو الذهاب الى اختيار الدليل الذي يحتوي على tnimgs وتحليل المجلد ، وهو ما يعني واحد سوف حدد الدليل المثال بدلا من أي من هذه الدلائل. ضرب حدد، وسوف يطلب منك، ما هو معامل القص من هذا الجل؟ معامل القص هو 1250 وسماكة الهيدروجيل في هذا المثال هو 118 ميكرون.

يتم توفير مستوى الضوضاء المتوقع هنا. ثم، يعني الإزاحة هو علامة صفر، والتي لم يتم التحقق في هذه الحالة. حدد موافق، والتنفيذ الذي يحسب الجر ينفذ عبر وظيفة MATLAB، وهي الطريقة التي يتم تنفيذها في هذا الإصدار من AnViM.

وهي الآن على استعداد لإجراء حساب لخلايا الخلية أو القوى الهيكل الخلوي. والسؤال الأول الذي يجب طرحه هو، هل التقاء الطبقة الأحادية؟ في هذه الحالة بالذات ، لدينا طبقة أحادية متقدمة ولا توجد منطقة خلية على الجانب الأيمن من الإطار.

لذا فإن الجواب هو أن الطبقة الأحادية ليست التقاء، لذلك نحن ذاهبون لنقول لا. الآن يطلب منا رسم مضلع حول أكبر كائن غير الخلية. نختار الطرق المناسبة للتجزئة.

هنا يطلب منا أن تشير إلى لون الخلايا في الأساليب ثلاثة وأربعة، حتى هنا الخلايا هي سوداء لذلك سوف نختار الأسود. وينتهي التقسيم الذي يتم إنتاجه من هذه الطرق المختلفة ببعض الثقوب في الطبقة أحادية الخلية وبعض المناطق البيضاء في منطقة الخلية بدون. هنا يمكننا اختيار وملء البقع تلقائيا وضرب OK.So الآن يتم ملء جميع البقع في الطبقة الأحادية ولا توجد منطقة خلية.

وبعد ذلك، سنقوم بحساب الضغوط الميكانيكية في الطبقة الخلوية الأحادية. لقد قمنا بالفعل بأداء الجزء الأول حيث قمنا بتقسيم الخلايا من منطقة عدم وجود خلية ، لذلك نبدأ هذه الخطوة بالجزء الثاني الذي هو تجزئة الخلايا الفردية والصور. واحد هو الذهاب الى اختيار تجزئة للخلايا الفردية.

وهنا يطلب منا اختيار دليل المواقف. وهناك بعض المعلومات الواردة هنا لهذه المعلمات. ثم يطلب منك رسم مضلع حول أصغر خلية عادية.

إذا ما ترسمه هنا يستخدم لحساب المساحة وسينص على أن أي شيء أصغر من هذا لا يعرف كخلية. وبعد ذلك يسأل عن أكبر خلية. ثم نرسم مضلع حول أكبر خلية عادية، ثم يسأل، أيهما أكثر إشراقا؟

هل واجهة الخلية الخلية أكثر سطوعا أم أن مراكز الخلايا أكثر سطوعا؟ لذا في هذه الحالة، واجهة الخلية الخلية أكثر إشراقا لذلك أنا ذاهب لتحديد واجهة الخلية الخلية. وهذا يشير إلى أن الحساب قد اكتمل.

لنبدأ بتحديد الخريطة على كثافة الخلايا. أولا، تطلب iTACS من المستخدم تحديد دليل الموضع، والذي يعرف أيضا باسم مجلد P0. عند الانتهاء، انقر فوق تحديد.

ثم يسأل المستخدم عما إذا كان يريد أن يكتشف iTACS انقسام الخلايا أو تحديد فترة الفلورسينس الخلوية. في هذه الحالة، ليس لدينا أي بروتينات فلورية داخل الخلية لذلك سنختار الكشف عن انقسام الخلايا. الشريحة التالية تمكن المستخدم من تحديد حجم المنطقة المجاورة، وهذا هو تحليل فريد أن AnViM ينفذ حيث ينظر إلى خصائص الخلايا الفردية وكذلك خصائص الخلايا المجاورة للمنطقة.

هنا، يمكن للمستخدم اختيار عرض الخلايا المجاورة للمنطقة. في هذه الحالة، نحدد المناطق المجاورة مع 60 بكسل. يسأل مربع الاختيار الأول ما إذا كنا نريد iTACS لجمع خصائص الخلايا، نعم نفعل، وهذا الاختيار يسأل ما إذا كنا نريد iTACS لجمع خصائص الجيران، نعم، نريد iTACS للقيام بذلك أيضا.

أسفل خانات الاختيار هذه، يوفر iTACS المزيد من المعلومات حول خانات الاختيار إذا كان المستخدم يرغب في مزيد من التفاصيل حول كل خانة اختيار. هذا يشير إلى أن التحليل قد اكتمل. مرة أخرى، تطلب iTACS من المستخدم تحديد دليل الموضع.

ثم، يتم إعطاء المستخدم خيار لرسم خريطة بيانات القوة، وخلق صور للبيانات القوة، والبيانات سرعة الخريطة، وخلق صور للبيانات السرعة. من المهم ملاحظة أن إنشاء الصور يستغرق وقتا ، لذلك يمكن للمرء أن يختار القيام بذلك الآن أو الانتظار للقيام بذلك لاحقا. لهذا السبب يتم إعطاء المستخدم خيار تحديد الخيارات أم لا.

هنا ، يطلب iTACS من المستخدم تحديد حجم المنطقة المجاورة مرة أخرى ، ويمكنك استخدام نفس الحجم الذي حددته لكثافة التعيين ، والذي كان 60 بكسل ، في حالتنا. ومرة أخرى ، يطلب من المستخدم جمع خصائص الخلايا وكذلك المنطقة المجاورة لها. هذا يشير إلى أن التحليل قد اكتمل.

في المجهر الإجهاد أحادي الطبقة، أو القائمة المنسدلة MSM، حدد نتائج تتبع البيانات. أولا، تطلب iTACS من المستخدم تحديد دليل الموضع، والذي يعرف أيضا باسم مجلد P0. عند الانتهاء، انقر فوق تحديد.

هنا، يسأل iTACS عن رقم الإطار الذي يريد المستخدم أن يبدأ iTACS في تتبع البيانات منه. من الآمن جدا البدء في التتبع من الإطار رقم اثنين ، لأنه لا يمكن تحديد السرعة للإطار رقم واحد. هنا ، يطلب iTACS من المستخدم الإشارة إلى الحد الأقصى لعدد المؤامرات التي يجب ملؤها في وقت واحد.

وأساسا ، وهذا هو وسيلة لتسريع تتبع البيانات. عند الانتهاء، انقر فوق موافق، ويتم تقديم خيارات اختيار المتغيرات أثناء التتبع بطريقة مشابهة لخيارات إنشاء خرائط الحرارة. يتم توفير الخصائص الشائعة ذات الاهتمام في مربع النص في أعلى الإطار.

ولكن إذا كنت ترغب في تخصيص المتغيرات الخاصة بك، تحتاج ببساطة إلى حذف كل شيء في مربع النص وتحديد خصائص محددة المدرجة أدناه. في المجهر الإجهاد أحادي الطبقة، أو MSM القائمة المنسدلة، حدد رسم النتائج. بعد ذلك، تطلب iTACS من المستخدم إذا كان المستخدم يريد الحد من التآمر على الخلايا ذات المسار غير المنقطع.

إذا كنت لا تريد قصر التآمر على المسارات غير المنقطعة ، فانقر فوق No.ولكن إذا كنت تريد قصر التآمر على الخلايا ذات المسارات غير المنقطعة ، فانقر فوق Yes Here iTACS يسأل عن عدد المتغيرات التي يريد المستخدم أن يرسمها البرنامج. iTACS قادر على رسم ما يصل إلى ثلاثة متغيرات، وفي هذه الحالة، سنقوم برسم متغيرين فقط لرؤية العلاقة بين تلك العوامل. في المجهر الإجهاد أحادي الطبقة، أو MSM القائمة المنسدلة، حدد صورة النتائج.

إليك دليل الموضع، وعند الانتهاء، انقر فوق تحديد. ثم يطلب منا iTACS اختيار إطار البداية. هنا ، اخترنا الإطار رقم اثنين.

يتم تقديم خيارات صنع الخرائط الحرارية بطريقة مماثلة لخيارات رسم المسارات الزمنية للخلايا الفردية. مع ذلك ، نستنتج كيفية إنشاء خريطة حرارية. هنا يمثل الأثر الزمني للسرعة الخلوية في توتر الهيكل الخلوي للخلية رقم واحد.

يتم عرض الخصائص على محور عمودي مشترك ويشير المحور الأفقي إلى رقم مثيل الوقت، حيث يتم الحصول على الإطارات في فواصل زمنية مدتها 15 دقيقة. الإخراج الثاني هو مجموعة من الخرائط الحرارية ساعة واحدة في التجربة. وتشمل الخصائص المعروضة هنا منطقة الانتشار، والتوجه، والتعميم، والسرعة، واتجاه الحركة، والتوجه الأقصى للتوتر، والتوتر الهيكل الخلوي، والجر الركيزة، وانزعاج التوتر للخلايا الفردية.

إذا هذه لمحة عن مجموعة واحدة من التجارب. هناك العديد من الحالات التجريبية الأخرى حيث يمكن أن تساعد AnViM و AcTrM المستخدم على إجراء التجربة بشكل مستنسخ ويتم سرد هذه الاتصالات في المخطوطة. تتضمن بعض الميزات الرئيسية ل iTACS أتمتة البروتوكول التجريبي ، وتحليل البيانات الآلي ، ولا يلزم وجود خلفية هندسية.