المقايسات القائمة على التلألؤ الكيميائي للكشف عن أكسيد النيتريك ومشتقاته من الأتمتة ومركبات النيتروجين

يمكن هذا البروتوكول الباحثين من استخدام كاشف التلألؤ الكيميائي ببراعة لقياس مستقلبات أكسيد النيتريك دون توجيه أو تكلفة توظيف موظفين متخصصين في الموقع. الفحص القائم على التلألؤ الكيميائي هو الطريقة الأكثر حساسية للكشف عن الحد الأدنى من التغيرات في مستويات أكسيد النيتريك ومستقلباته في أي عينة بيولوجية معينة. أكسيد النيتريك المستنشق هو غاز علاجي يستخدم لمجموعة واسعة من الأمراض.

من الأهمية بمكان أن يرتبط تطور المرض والتعافي منه ارتباطا دقيقا بمستويات مستقلب أكسيد النيتريك. أكسيد النيتريك المستنشق ، وهو مضاد للميكروبات ، يظهر وعدا في علاج المرضى الذين يعانون من الأمراض المعدية في مجرى الهواء. توفر طريقة التلألؤ الكيميائي نظرة ثاقبة على جرعة أكسيد النيتريك المرتبطة ومستقلباته مع التغيرات الميكروبيولوجية والفيزيولوجية المرضية.

لتحضير محلول DETA-NONOate ، أضف 10 ملليغرام من DETA-NONOate إلى 610 ميكرولتر من هيدروكسيد الصوديوم 10 ملليمولار في PBS من الرقم الهيدروجيني 7.4 لتوليد 100 ملليمول من DETA-NONOate وإبقائه على الجليد. للمتابعة ، قم بتوصيل خط الأكسجين بكاشف التلألؤ الكيميائي وافتح خزان الأكسجين عند الضغط وفقا لتعليمات الشركة المصنعة الواردة في النص. ثم قم بتوصيل خط المرشح العازل للمجال المكثف بكاشف التلألؤ الكيميائي.

على واجهة كاشف التلألؤ الكيميائي ، ابدأ في تشغيل برنامج الكشف عن فحوصات الطور السائل ، مما يضمن أن إمدادات الأكسجين كافية وسيبدأ الكاشف في أخذ العينات ، مما يشير إلى الكشف عن طريق الإشارة بالمللي فولت ، وإلا ستدفع بإشارة تشخيصية سلبية. لإعداد وعاء التطهير ، أغلق وعاء التطهير في جميع الموانئ الثلاثة عن طريق شد صمام الإبرة بالكامل إلى اليمين وإغلاق ديوك إيقاف المدخل والمخرج. قم بإزالة الغطاء من وعاء التطهير.

أضف كمية كافية من الكاشف الخاص بالفحص المخطط له إلى غرفة التفاعل بحيث يمكن لإبرة المحقنة المستخدمة في حقن العينات الوصول إلى عمود السائل مع التحقق من وجود خط أساس مستقر ومرغوب فيه. لبدء تدفق غاز التطهير ، تأكد من أن خزان الغاز الخامل مجهز بمنظم من مرحلتين ، وقم بتوصيل خزان الغاز الخامل بمدخل الغاز في السفينة. ثم افتح مخرج وعاء التطهير وافتح الغاز بضغط مخرج عند المنظم من واحد إلى خمسة أرطال لكل بوصة مربعة.

بعد ذلك ، افتح مدخل وعاء التطهير وافتح ببطء صمام الإبرة لوعاء التطهير للسماح بتدفق الغاز والتحقق من الفقاعات داخل وعاء التطهير. لضبط تدفق الغاز، سجل ضغط الخلية الذي تم قياسه بواسطة كاشف التلألؤ الكيميائي باستخدام خط المرشح العازل للمجال المكثف الذي يأخذ عينات من الهواء المحيط. أعد وضع الغطاء الموجود على وعاء التطهير وقم بتوصيل خط المرشح العازل للمجال المكثف بوعاء التطهير.

استخدم صمام الإبرة للوصول إلى نفس ضغط الخلية عند مستوى كاشف التلألؤ الكيميائي المسجل في الهواء المحيط. لبدء تشغيل برنامج اكتساب إشارة التلألؤ الكيميائي، قم بتوصيل المنفذ التسلسلي لكاشف التلألؤ الكيميائي بالمنفذ التسلسلي للكمبيوتر الذي تم تثبيت برنامج الاكتساب عليه. ثم قم بتشغيل برنامج التحليل.

انقر فوق اكتساب ، ثم حدد المجلد لحفظ ملف البيانات ، واكتب اسم الملف ، وانقر فوق حفظ. أثناء التحضير لحقن العينة، اضبط مقياس الجهد على الشاشة للتحكم في خط الأساس المستهدف بالنقر فوق الأزرار الدنيا و/أو القصوى، ثم إدخال القيمة المطلوبة. لإجراء حقن العينة، اشطف المحقنة مرتين أو أكثر على الأقل بالماء منزوع الأيونات والمقطر قبل سحب كل عينة، وتأكد من إخراج الماء دون عائق على مسح المهمة.

ثم أدخل المحقنة في أنبوب العينة مع الاحتفاظ بكل من المحقنة والأنبوب على مسافة قريبة واسحب المكبس إلى الحجم المطلوب مع ضمان عدم وجود فقاعة هواء أو أجزاء صلبة غير متجانسة. نظف طرف المحقنة باستخدام ممسحة المهام وأدخل المحقنة في غطاء الضبط في منفذ الحقن. بعد التحقق من أن طرف المحقنة ضمن المرحلة السائلة ، قم بحقن العينة في غرفة التفاعل.

لوضع علامة على الحقن في البرنامج ، اكتب اسم العينة بالنقر فوق المربع الرمادي ضمن أسماء العينات ، ثم انقر فوق Mark Injection أثناء التحقق من أن الحقن يسبب تغييرا صعوديا في الإشارة أو لأسفل في استهلاك أكسيد النيتريك عن طريق فحص الهيموغلوبين الخالي من الخلايا. تم قياس علاقة الاستجابة للجرعة بين الهيموغلوبين الخالي من الخلايا واستهلاك أكسيد النيتريك من خلال التلألؤ الكيميائي بعد المجازة القلبية الرئوية. يمكن افتراض أن هناك تركيزا عاليا من مجموعات الهيم في الحالة المؤكسدة لإزالة أكسيد النيتريك.

في المرضى الذين يتلقون أكسيد النيتريك أثناء المجازة القلبية الرئوية ، بدلا من ذلك ، يتم تقليل غالبية مجموعات الهيم ولا تستهلك أكسيد النيتريك. أشارت قياسات تركيز الهيموغلوبين الخالي من الخلايا إلى التخلص البطيء من البلازما في غضون 12 ساعة بعد المجازة القلبية الرئوية. ومع ذلك ، بلغ استهلاك أكسيد النيتريك ذروته في 15 دقيقة ولم يعكس القضاء على الهيموغلوبين الخالي من الخلايا.

أظهرت منحنيات الانحدار الخطي لاستهلاك أكسيد النيتريك بواسطة الهيموغلوبين الخالي من الخلايا انتشارا للهيموغلوبين المؤكسد والمستهلك لأكسيد النيتريك في 15 دقيقة ، مقابل انخفاض الهيموجلوبين عند خط الأساس 4 ساعات و 12 ساعة بعد المجازة القلبية الرئوية. تم رصد آثار إعطاء غاز أكسيد النيتريك على استهلاك أكسيد النيتريك. عندما عولج المرضى بغاز أكسيد النيتريك أثناء وبعد العملية الجراحية ، لم تقترن الزيادة الملحوظة في الهيموغلوبين الحر بعد المجازة القلبية الرئوية بأي زيادة في استهلاك أكسيد النيتريك.

أشارت النتائج إلى أن أكسيد النيتريك الذي يتم إعطاؤه خارجيا يقلل من معظم الهيموغلوبين الحر ويمنع كسح أكسيد النيتريك. لا تكون التجربة صالحة إلا إذا ظلت جميع الشروط كما هي. إذا تجاوز ارتفاع مستوى السائل عمود التفاعل ، فيجب أن نتوقف ونجري معايرة جديدة.