زرع الخلايا الدبقية الصغيرة المشتقة من الخلايا الجذعية متعددة القدرات التي يسببها الإنسان في دماغ الفئران المناعية عبر طريق الأنف غير الغازي
مايو 31, 2022
يسمح البروتوكول المعروض هنا بزرع الخلايا الدبقية البشرية المستحثة متعددة القدرات المشتقة من الخلايا الجذعية (iPSMG) في الدماغ عبر طريق عبر الأنف في الفئران المناعية. يتم عرض طريقة تحضير وزرع الخلايا عبر الأنف وإدارة خليط السيتوكين للحفاظ على iPSMG.
يسمح هذا البروتوكول بزرع iPSMG بشكل غير جراحي في دماغ الفأر المناعي من خلال الجمع بين تشغيل / إيقاف الدوائية لمضاد مستقبلات CSF1 PLX5622 مع الزرع عبر الأنف. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنه يمكن زرع iPSMG دون التسبب في تلف الدماغ حتى في الفئران ذات الكفاءة المناعية. قد تكون زراعة الخلايا الدبقية الدقيقة بمثابة علاج محتمل لتبادل الخلايا الدبقية الصغيرة المختلة وظيفيا مع تلك الوظيفية في مختلف الأمراض العصبية التنكسية في المستقبل.
سيوضح الإجراء بيجاي باراجولي ، وهو باحث من مختبري. ابدأ بسرعة بإذابة الخلايا الدبقية البشرية المستحثة متعددة القدرات المجمدة المستمدة من الخلايا الجذعية في حمام مائي بزاوية 37 درجة مئوية. قم بتدوير العينات حتى يذوب الجليد المرئي.
أضف iPSMG المذاب إلى وسائط الثقافة ، التي تم تسخينها إلى 37 درجة مئوية. أضف ملليلتر واحد من الخلايا إلى 10 ملليلتر من وسائط الثقافة. الطرد المركزي للخلايا في 300 مرة غرام لمدة خمس دقائق للحصول على بيليه الخلية.
إزالة supernatant دون إزعاج بيليه الخلية. أضف وسط الزرع للحصول على تركيز خلية من 10 إلى الخلايا الخامسة لكل ميكرولتر. ضع iPSMG على الجليد ، وانتقل على الفور إلى الزرع.
لإعداد الفئران لزرع الأنف ، قم بإطعام الفئران الذكور بنظام غذائي يحتوي على PLX لمدة سبعة أيام. في نهاية اليوم السابع ، توقف عن اتباع نظام PLX الغذائي وأطعم الفئران بنظام غذائي طبيعي. قبل ساعة واحدة من زرع iPSMG عبر الأنف ، قم بإعطاء 2.5 ميكرولتر من الهيالورونيداز في PBS لكل فتحة أنف مرتين باستخدام طرف ماصة 10 ميكرولتر لزيادة نفاذية الغشاء المخاطي للأنف.
ضع الفئران في وضع ضعيف بعد تطبيق الهيالورونيداز. إدارة 2.5 ميكرولتر من الهيالورونيداز قبل عشر دقائق من زرع iPSMG عبر الأنف. ضع 2.5 ميكرولتر من تعليق الخلية في فتحة أنف واحدة من الماوس باستخدام طرف ماصة سعة 10 ميكرولترات.
ضع الماوس في وضع ضعيف لمدة خمس دقائق قبل إعطاء تعليق الخلية إلى فتحة الأنف الأخرى. إدارة تعليق الخلية أربع مرات ، وتطبيق حجم إجمالي قدره 20 ميكرولتر لكل. بعد 48 ساعة من توقف تغذية PLX ، كرر إعطاء الهيالورونيداز وتعليق الخلايا على نفس الفئران.
لإدارة السيتوكينات ، ضع 2.5 ميكرولتر من وسط الزرع في فتحة أنف واحدة من الماوس باستخدام طرف ماصة 10 ميكرولتر. بعد شهرين من الزرع عبر الأنف ، يمكن تحديد عدد الخلايا المزروعة عن طريق حساب الخلايا الإيجابية لكل من العلامات الخاصة بالإنسان والعلامات الدبقية الصغيرة. الخلايا الدبقية الصغيرة للفئران الذاتية المنشأ إيجابية لعلامة عموم الخلايا الدبقية الصغيرة فقط.
في الفئران الضابطة ، تم اكتشاف الخلايا الدبقية الصغيرة للفئران فقط في كل من القشرة والحصين. في قشرة الفئران المزروعة iPSMG ، تم اكتشاف الخلايا الدبقية الصغيرة للفئران فقط ، بينما تم اكتشاف iPSMG في الحصين. عند محاولة هذا البروتوكول ، تعد الإزالة الكاملة لل supernatant ضرورية لمنع تخفيف السيتوكينات.
من الأهمية بمكان تطبيق السيتوكين كل 12 ساعة من أجل بقاء الخلايا المزروعة. مطلوب استنفاد الخلايا الدبقية الصغيرة للفئران الذاتية المنشأ لزرع iPSMG. يسمح هذا الإجراء بزرع iPSMG في دماغ فأر طبيعي أو مريض.
وبالتالي ، يمكن تحديد خصائص iPSMG وكذلك الاستجابة للمرض. هذه التقنية مناسبة لتحديد الخاصية في الجسم الحي ل iPSMG في دماغ الماوس. وبالتالي ، فإن زرع iPSMG في الفئران النموذجية للمرض سيساعدنا على فهم الاستجابة وقد يمهد الطريق لهدف علاجي جديد.
نظرة عامة
تقدم هذه الدراسة طريقة غير جراحية لزراعة الخلايا الدبقية الصغيرة البشرية المشتقة من الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات (iPSMG) في أدمغة الفئران ذات الكفاءة المناعية عبر المسار الأنفي. يعتمد البروتوكول على إعطاء السيتوكينات وحذف الخلايا الدبقية الصغيرة الداخلية لتمكين التكامل الفعال لـ iPSMG، مما قد يمهد الطريق لنهج علاجية في الأمراض التنكسية العصبية.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلم
- علم الأعصاب
- أبحاث الخلايا الجذعية
- بيولوجيا الخلايا الدبقية الصغيرة
خلفية علمية
- يمكن تمايز الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات إلى خلايا دبقية صغيرة وظيفية.
- يرتبط خلل وظائف الخلايا الدبقية الصغيرة بالعديد من الأمراض التنكسية العصبية.
- يمثل التوصيل عبر الأنف نهجًا جديدًا لزراعة الخلايا.
- يعد إعطاء السيتوكينات أمرًا بالغ الأهمية لبقاء الخلايا على قيد الحياة بعد عملية الزراعة.
الغرض من الدراسة
- تطوير طريقة لزراعة الخلايا الدبقية الصغيرة بطريقة غير جراحية.
- تقييم جدوى الإيصال عبر الأنف في الحفاظ على وظائف الدماغ الطبيعية.
- تقييم قدرة iPSMG على استبدال الخلايا الدبقية الصغيرة المختلة وظيفياً.
الطرق المستخدمة
- تتضمن المنصة الأساسية عملية زرع الخلايا الدبقية الصغيرة المشتقة من الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات (iPSMG) عبر الأنف في فئران ذات كفاءة مناعية.
- تمت معالجة الفئران الذكور مسبقاً بمضاد مستقبل CSF1 وهو PLX5622 ومحلول هيالورونيداز لتعزيز النفاذية الأنفية.
- أُعطيت معلقات الخلايا في جرعات متعددة على جداول زمنية محددة لضمان الاندماج السليم.
- تضمنت مراقبة ما بعد الزرع تقييم وجود الخلايا المزروعة ومدى حيويتها.
النتائج الرئيسية
- تم دمج خلايا iPSMG المزروعة بنجاح في حصين الفأر دون إتلاف الخلايا الدبقية الصغيرة الداخلية.
- كان إعطاء السيتوكينات كل 12 ساعة أمراً حاسماً للحفاظ على حيوية الخلايا بعد عملية الزرع.
- تسمح هذه الطريقة بفحص استجابات خلايا iPSMG في كل من النماذج الطبيعية والمرضية.
الاستنتاجات
- يسهل هذا البروتوكول دراسة iPSMG داخل الجسم الحي، مما قد يفيد العلاجات الجينية المستقبلية للأمراض التنكسية العصبية.
- يمكن أن يساعد فهم سلوك الخلايا الدبقية الصغيرة المزروعة في تحديد دورها في صحة الدماغ.
- قد يفتح هذا النهج آفاقاً لأهداف علاجية جديدة في علاج الأمراض المرتبطة بالخلايا الدبقية الصغيرة.
الأسئلة الشائعة
الأهمية الصناعية التنفيذية
تتيح عملية الزرع غير الباضعة للخلايا الدبقية الصغيرة المشتقة من الخلايا الجذعية البشرية المحفزة متعددة القدرات (iPSC) في أدمغة الفئران ذات الكفاءة المناعية دراسة مباشرة في الجسم الحي لوظيفة الخلايا الدبقية الصغيرة البشرية واستجابتها للمرض. ويعالج هذا النهج الفجوات الانتقالية بين الخلايا الدبقية الصغيرة لدى القوارض والبشر، مما يدعم نماذج قبل سريرية أكثر قدرة على التنبؤ لأبحاث الأمراض التنكسية العصبية. كما يعزز هذا البروتوكول من التحقق من الأهداف وتقليل المخاطر الآلية في نقاط التحول المبكرة للاكتشاف والمراحل قبل السريرية.
التطبيقات الاستراتيجية في البحث والتطوير الصيدلاني الحيوي
الاكتشاف المبكر والتحقق من الهدف
- يتيح استقصاء بيولوجيا الخلايا الدبقية الصغيرة البشرية في الجسم الحي (in vivo) ضمن بيئة دماغ الثدييات.
- يدعم تقليل المخاطر الميكانيكية من خلال التمييز بين استجابات الخلايا الدبقية الصغيرة الخاصة بالبشر وتلك الموجودة في النماذج الفأرية.
- يسهل التحقق الوظيفي من الأهداف الخاصة بمسارات الالتهاب العصبي والتحلل العصبي.
الفحص وتطوير المقايسة
- يوفر نظاماً تم التحقق من صحته لتقييم اندماج الخلايا الدبقية الصغيرة البشرية وقابليتها للحياة في الجسم الحي (in vivo).
- يتيح القياس الكمي القابل للتكرار للخلايا الدبقية الصغيرة المزروعة مقابل تلك الداخلية باستخدام علامات محددة.
- يدعم الفرز اللاحق للمركبات التي تستهدف وظيفة الخلايا الدبقية الصغيرة البشرية في سياق فسيولوجي.
الأبحاث الانتقالية وما قبل السريرية
- يوائم النماذج قبل السريرية مع الصلة بالمرض البشري من خلال دمج الخلايا الدبقية الصغيرة البشرية في أدمغة الفئران.
- يتيح تقييم استجابة الخلايا الدبقية الصغيرة البشرية في كل من الفئران الطبيعية وفئران نماذج الأمراض.
- يعزز الثقة التنبؤية لاكتشاف المؤشرات الحيوية الانتقالية واختبار الفرضيات العلاجية.
تكامل مسارات العمل وسير العمل
يربط هذا البروتوكول بين مرحلة الاكتشاف المبكر والأبحاث قبل السريرية من خلال تمكين الدراسات الوظيفية للخلايا الدبقية الصغيرة البشرية في الجسم الحي (in vivo)، مما يدعم تحديد المركبات الرائدة والاستمرارية الانتقالية.
- بيولوجيا الاكتشاف: يدعم اختبار الفرضيات حول أدوار الخلايا الدبقية الصغيرة البشرية في فسيولوجيا الدماغ وباثولوجيته.
- الفحص: يوفر قراءات كمية لاندماج الخلايا وحيويتها بعد عملية الزرع.
- التحليلات: يتيح التمييز القائم على العلامات بين الخلايا الدبقية الصغيرة البشرية والفئران من أجل تحليل بيانات قوي.
- الأبحاث الترجمية: يسهل النمذجة ذات الصلة بالأمراض عن طريق زرع iPSMG في فئران نماذج الأمراض.
- إعادة الاستخدام المؤسسي: يؤسس منصة قابلة لإعادة الاستخدام لتقييم وظيفة الخلايا الدبقية الصغيرة البشرية عبر سياقات مرضية متعددة.
التأثير التشغيلي والمؤسسي
- القيمة العلمية: تعزز الثقة التنبؤية وتقلل من الغموض المرتبط بنوع الكائن الحي في أبحاث الالتهاب العصبي.
- القيمة التشغيلية: توحد سير عمل توصيل الخلايا وتقديرها كمياً بطرق غير جراحية لضمان إمكانية تكرار النتائج عبر الدراسات المختلفة.
- القيمة الاستراتيجية: تتيح اتخاذ قرارات أفضل بشأن المضي قدماً أو التوقف في تطوير العلاجات التي تستهدف الخلايا الدبقية الصغيرة من خلال توفير بيانات ذات صلة بالبشر.
- التأثير على المحفظة البحثية: تدعم تحديد الأولويات المعدلة حسب المخاطر لبرامج الأمراض التنكسية العصبية من خلال تحسين دقة النموذج.
اعتبارات التنفيذ
- يتطلب خبرة في زراعة الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات (iPSC)، وتمايز الخلايا الدبقية الصغيرة، وتقنيات الزرع في الجسم الحي (in vivo).
- يتطلب الوصول إلى العوامل الدوائية اللازمة لاستنفاد الخلايا الدبقية الصغيرة الداخلية والدعم بالسيتوكينات.
- يتطلب بروتوكولات موحدة لتحضير الخلايا، والزرع، والتحليل بعد عملية الزرع.
- قد يتطلب التكيف مع أنظمة نماذج أخرى تحسيناً لمعايير التوصيل والاستنفاد.
- يعد الإعطاء المستمر للسيتوكينات أمراً حاسماً لبقاء الخلايا المزروعة على قيد الحياة، كما يدعم ذلك البروتوكول.
