Transplantation of Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Microglia in Immunocompetent Mice Brain via Non-Invasive Transnasal Route

Bijay Parajuli; Youichi Shinozaki; Eiji Shigetomi; Schuichi Koizumi

doi:10.3791/63574

زرع الخلايا الدبقية الصغيرة المشتقة من الخلايا الجذعية متعددة القدرات التي يسببها الإنسان في دماغ...

JoVE Journal
Neuroscience

This content is Free Access.

JoVE Journal Neuroscience

Transplantation of Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Microglia in Immunocompetent Mice Brain via Non-Invasive Transnasal Route

زرع الخلايا الدبقية الصغيرة المشتقة من الخلايا الجذعية متعددة القدرات التي يسببها الإنسان في دماغ الفئران المناعية عبر طريق الأنف غير الغازي

Full Text

3,422 Views

05:35 min

May 31, 2022

DOI: 10.3791/63574-v

Bijay Parajuli^1,2, Youichi Shinozaki^1,2, Eiji Shigetomi^1,2, Schuichi Koizumi^1,2

¹Department of Neuropharmacology, Interdisciplinary Graduate School of Medicine,University of Yamanashi, ²GLIA Center,University of Yamanashi

Please note that some of the translations on this page are AI generated. Click here for the English version.

Overview

This study presents a non-invasive method for the transplantation of induced pluripotent stem cell-derived human microglia (iPSMG) into the brain of immunocompetent mice via a transnasal route. The protocol leverages cytokine administration and the deletion of endogenous microglia to enable effective integration of iPSMG, potentially paving the way for therapeutic approaches in neurodegenerative diseases.

Key Study Components

Area of Science

Neuroscience
Stem Cell Research
Microglial Biology

Background

Induced pluripotent stem cells can be differentiated into functional microglia.
Microglial dysfunction is implicated in various neurodegenerative diseases.
Transnasal delivery presents a novel approach to cell transplantation.
Administering cytokines is crucial for cell viability post-transplantation.

Purpose of Study

To develop a method for non-invasive microglial transplantation.
To assess the feasibility of transnasal delivery in maintaining normal brain function.
To evaluate the potential of iPSMG in replacing dysfunctional microglia.

Methods Used

The primary platform involves transnasal transplantation of iPSMG in immunocompetent mice.
Male mice were pre-treated with CSF1 receptor antagonist PLX5622 and a hyaluronidase solution to enhance nasal permeability.
Cell suspensions were administered in multiple doses over specified timelines to ensure proper integration.
Post-transplant monitoring involved assessing the presence and viability of transplanted cells.

Main Results

Transplanted iPSMG were successfully integrated into the mouse hippocampus without damaging endogenous microglia.
Cytokine administration every 12 hours was critical for maintaining cell viability after transplantation.
This method allows the examination of iPSMG responses in both normal and diseased models.

Conclusions

This protocol facilitates the study of iPSMG in vivo, which could inform future gene therapies for neurodegenerative diseases.
Understanding the behavior of transplanted microglia can help delineate their role in brain health.
This approach may open avenues for novel therapeutic targets in treating microglial-related pathologies.

Frequently Asked Questions

What are the advantages of transnasal transplantation?

Transnasal transplantation is a non-invasive approach that minimizes brain damage and allows for direct delivery of cells into the brain.

How is the microglial cell model prepared?

Microglial cells are prepared from induced pluripotent stem cells, thawed, and cultured before transplantation.

What types of outcomes can be measured post-transplantation?

Outcomes include the integration of iPSMG into the brain tissue and their functional viability, assessed through specific marker detection.

Can this method be adapted for other types of cells?

While primarily designed for iPSMG, the transnasal delivery method may potentially be adapted for other cell types, pending compatibility.

What are the limitations of this protocol?

Limitations include the requirement for careful preparation of cells and the need for continuous cytokine administration to ensure cell viability.

يسمح البروتوكول المعروض هنا بزرع الخلايا الدبقية البشرية المستحثة متعددة القدرات المشتقة من الخلايا الجذعية (iPSMG) في الدماغ عبر طريق عبر الأنف في الفئران المناعية. يتم عرض طريقة تحضير وزرع الخلايا عبر الأنف وإدارة خليط السيتوكين للحفاظ على iPSMG.

يسمح هذا البروتوكول بزرع iPSMG بشكل غير جراحي في دماغ الفأر المناعي من خلال الجمع بين تشغيل / إيقاف الدوائية لمضاد مستقبلات CSF1 PLX5622 مع الزرع عبر الأنف. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنه يمكن زرع iPSMG دون التسبب في تلف الدماغ حتى في الفئران ذات الكفاءة المناعية. قد تكون زراعة الخلايا الدبقية الدقيقة بمثابة علاج محتمل لتبادل الخلايا الدبقية الصغيرة المختلة وظيفيا مع تلك الوظيفية في مختلف الأمراض العصبية التنكسية في المستقبل.

سيوضح الإجراء بيجاي باراجولي ، وهو باحث من مختبري. ابدأ بسرعة بإذابة الخلايا الدبقية البشرية المستحثة متعددة القدرات المجمدة المستمدة من الخلايا الجذعية في حمام مائي بزاوية 37 درجة مئوية. قم بتدوير العينات حتى يذوب الجليد المرئي.

أضف iPSMG المذاب إلى وسائط الثقافة ، التي تم تسخينها إلى 37 درجة مئوية. أضف ملليلتر واحد من الخلايا إلى 10 ملليلتر من وسائط الثقافة. الطرد المركزي للخلايا في 300 مرة غرام لمدة خمس دقائق للحصول على بيليه الخلية.

إزالة supernatant دون إزعاج بيليه الخلية. أضف وسط الزرع للحصول على تركيز خلية من 10 إلى الخلايا الخامسة لكل ميكرولتر. ضع iPSMG على الجليد ، وانتقل على الفور إلى الزرع.

لإعداد الفئران لزرع الأنف ، قم بإطعام الفئران الذكور بنظام غذائي يحتوي على PLX لمدة سبعة أيام. في نهاية اليوم السابع ، توقف عن اتباع نظام PLX الغذائي وأطعم الفئران بنظام غذائي طبيعي. قبل ساعة واحدة من زرع iPSMG عبر الأنف ، قم بإعطاء 2.5 ميكرولتر من الهيالورونيداز في PBS لكل فتحة أنف مرتين باستخدام طرف ماصة 10 ميكرولتر لزيادة نفاذية الغشاء المخاطي للأنف.

ضع الفئران في وضع ضعيف بعد تطبيق الهيالورونيداز. إدارة 2.5 ميكرولتر من الهيالورونيداز قبل عشر دقائق من زرع iPSMG عبر الأنف. ضع 2.5 ميكرولتر من تعليق الخلية في فتحة أنف واحدة من الماوس باستخدام طرف ماصة سعة 10 ميكرولترات.

ضع الماوس في وضع ضعيف لمدة خمس دقائق قبل إعطاء تعليق الخلية إلى فتحة الأنف الأخرى. إدارة تعليق الخلية أربع مرات ، وتطبيق حجم إجمالي قدره 20 ميكرولتر لكل. بعد 48 ساعة من توقف تغذية PLX ، كرر إعطاء الهيالورونيداز وتعليق الخلايا على نفس الفئران.

لإدارة السيتوكينات ، ضع 2.5 ميكرولتر من وسط الزرع في فتحة أنف واحدة من الماوس باستخدام طرف ماصة 10 ميكرولتر. بعد شهرين من الزرع عبر الأنف ، يمكن تحديد عدد الخلايا المزروعة عن طريق حساب الخلايا الإيجابية لكل من العلامات الخاصة بالإنسان والعلامات الدبقية الصغيرة. الخلايا الدبقية الصغيرة للفئران الذاتية المنشأ إيجابية لعلامة عموم الخلايا الدبقية الصغيرة فقط.

في الفئران الضابطة ، تم اكتشاف الخلايا الدبقية الصغيرة للفئران فقط في كل من القشرة والحصين. في قشرة الفئران المزروعة iPSMG ، تم اكتشاف الخلايا الدبقية الصغيرة للفئران فقط ، بينما تم اكتشاف iPSMG في الحصين. عند محاولة هذا البروتوكول ، تعد الإزالة الكاملة لل supernatant ضرورية لمنع تخفيف السيتوكينات.

من الأهمية بمكان تطبيق السيتوكين كل 12 ساعة من أجل بقاء الخلايا المزروعة. مطلوب استنفاد الخلايا الدبقية الصغيرة للفئران الذاتية المنشأ لزرع iPSMG. يسمح هذا الإجراء بزرع iPSMG في دماغ فأر طبيعي أو مريض.

وبالتالي ، يمكن تحديد خصائص iPSMG وكذلك الاستجابة للمرض. هذه التقنية مناسبة لتحديد الخاصية في الجسم الحي ل iPSMG في دماغ الماوس. وبالتالي ، فإن زرع iPSMG في الفئران النموذجية للمرض سيساعدنا على فهم الاستجابة وقد يمهد الطريق لهدف علاجي جديد.

Explore More Videos

علم الأعصاب العدد 183