جمع بيانات Cryo-EM أحادية الجسيمات مع إمالة المرحلة باستخدام Leginon
يوليو 1, 2022
يصف هذا البروتوكول مخططا معمما وسهل التنفيذ لجمع بيانات الجسيمات المفردة المائلة في تجارب cryo-EM. مثل هذا الإجراء مفيد بشكل خاص للحصول على خريطة EM عالية الجودة للعينات التي تعاني من تحيز التوجه التفضيلي بسبب الالتزام بواجهة الهواء والماء.
يوفر إمالة مرحلة العينة طريقة بسيطة وقابلة للتعميم لزيادة توزيع اتجاه الجسيمات أثناء جمع بيانات cryo-EM أحادية الجسيم. يتيح التوزيع الموحد للجسيمات التي تم الحصول عليها بسبب إمالة مرحلة العينة تحسين جودة الخريطة الإجمالية وإمكانية تفسيرها. ابدأ بمحاذاة المجهر لضمان الإضاءة المتوازية للعينة وتقليل انحرافات الغيبوبة.
لتحديد المربعات المناسبة لجمع البيانات ، قم بتسجيل أطلس الشبكة بدون إمالة المرحلة أو مع إمالة المرحلة ، مما يوفر نظرة عامة على الجودة الإجمالية للشبكة وإشارة أولية إلى المناطق المناسبة لجمع البيانات. افحص المربعات يدويا عند التكبير المستخدم في عقدة اكتساب المربع. ابحث عن المربعات التي تكون فيها الرقاقة سليمة ، ولا تبدو مجففة ، ولها سمك جليدي مثالي ، وانقل مرحلة العينة إلى مربع الاهتمام.
حدد الارتفاع المركزي لموضع المسرح باستخدام متذبذب ألفا عند إمالة المسرح بزاوية 15 درجة تقريبا واضبط ارتفاع Z لإحضار المرحلة إلى ارتفاع مركزي باستخدام لوحة المفاتيح للمجهر. تأكد من أن إزاحة الصورة ضئيلة أثناء روتين تمايل ألفا. للعثور على ارتفاع Z أكثر دقة ، قم بتقديره في عقدة التركيز عند التكبير المستخدم في عقدة الاستحواذ المربعة.
اضبط إعدادات عقدة التركيز وقم بتمكين أو تعطيل خيار التركيز Z الدقيق أثناء قائمة الانتظار الأولية للمربعات. ثم اضغط على محاكاة. قم بإمالة مرحلة العينة إلى زاوية الميل المطلوبة لجمع البيانات عند الارتفاع المركزي الحقيقي وإعادة توسيط المرحلة إذا لزم الأمر.
اضغط على محاكاة في عقدة الاستحواذ المربعة لبدء وضع الأهداف في قائمة الانتظار لتعرض عقدة الاستحواذ بالكامل. بعد ذلك ، حدد هدف تركيز Z والمناطق ذات الثقوب المناسبة لتعرض التكبير العالي وأرسل الأهداف إلى قائمة الانتظار للتصوير. أعد مرحلة العينة إلى حالتها غير المائلة ثم انتقل إلى المربع التالي.
كرر هذه الخطوات حتى يتم وضع عدد كاف من التعرضات الكاملة في قائمة الانتظار. بمجرد وضع جميع المربعات في قائمة الانتظار ، انتقل إلى عقدة الاستهداف بأكملها واضغط على إرسال الأهداف في قائمة الانتظار. حدد السماح بتحقق المستخدم من الأهداف المحددة في إعدادات العقدة وافحص الأهداف المحددة يدويا بواسطة عقدة اكتساب التعرض عالي التكبير لاختبار ما إذا كان بإمكان مكتشف ثقب EM الآلي تحديد المناطق المناسبة للحصول على الصورة بدقة عند إمالة مرحلة العينة.
بمجرد أن يشعر المستخدم بالرضا عن دقة الاستهداف، قم بإلغاء تحديد الخيار السماح بتحقق المستخدم من الأهداف المحددة لجمع البيانات تلقائيا. يتم عرض الصور التمثيلية للشبكة عند التكبير المربع بزوايا إمالة مختلفة تم جمعها بالقرب من ارتفاع Z المركزي وبعيدا عنه. يشار إلى مركز الحزمة بمركز الحلقات الحمراء متحدة المركز ويشير السهم الأخضر إلى مربع الاهتمام.
هناك ميزة شبكة مكسورة مجاورة لمربع الاهتمام كمرجع. تظهر هنا تعريضات الثقب التمثيلية ومتوسطات فئة 2D التي تم جمعها بزوايا إمالة 0 درجة و 30 درجة و 60 درجة. على الرغم من أن تركيز البروتين لم يتغير عبر زوايا الميل المختلفة ، إلا أن زاوية الميل الأعلى تجعل المنطقة المصورة تبدو أكثر ازدحاما من حيث تركيز الجسيمات.
يتم عرض متوسطات فئة 2D المتأثرة بالاكتظاظ في هذا المربع الأحمر. تسمح بساطة البروتوكول لأي مستخدم قياسي للمجهر بتكييف استراتيجية جمع البيانات المائلة بسهولة.
اعرض النص الكامل واحصل على الوصول إلى آلاف الفيديوهات العلمية
نظرة عامة
يحدد هذا البروتوكول طريقة مباشرة لتحسين جمع بيانات المجهر الإلكتروني بردّي التجميد (cryo-EM) للجسيمات المفردة من خلال إمالة منصة العينة. ويعد هذا النهج مفيداً بشكل خاص لتحسين جودة خرائط المجهر الإلكتروني للعينات التي تظهر انحيازاً في التوجه المفضل.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلم
- المجهر الإلكتروني المبرد (cryo-EM)
- البيولوجيا البنيوية
- تحليل الجسيمات المفردة
خلفية علمية
- يعد المجهر الإلكتروني المبرد للجسيمات المنفردة (Single-particle cryo-EM) أمرًا بالغ الأهمية لتحديد هياكل الجزيئات البيولوجية الكبيرة.
- غالبًا ما تواجه العينات انحيازًا في التوجه عند التصاقها بالأسطح.
- يمكن أن يؤدي تحسين توجه الجسيمات إلى تعزيز جودة الخريطة.
- يعد إمالة المسرح طريقة لتحقيق توزيع أكثر تجانسًا للجسيمات.
الغرض من الدراسة
- توفير بروتوكول لإمالة منصة العينات أثناء جمع بيانات المجهر الإلكتروني المبرد (cryo-EM).
- تقليل انحياز التوجه التفضيلي في العينات.
- تعزيز إمكانية تفسير خرائط المجهر الإلكتروني (EM).
الطرق المستخدمة
- ضبط المجهر لتحقيق الإضاءة المثلى.
- تسجيل أطلس للشبكة لتقييم جودتها.
- فحص المربعات للتأكد من استيفائها للشروط المثالية قبل جمع البيانات.
- اختيار المربعات يدويًا بناءً على سلامة الرقاقة وسمك الجليد.
النتائج الرئيسية
- يؤدي إمالة المنصة إلى زيادة توزيع اتجاهات الجسيمات.
- لوحظ تحسن في الجودة العامة للخريطة وقابليتها للتفسير.
- التحديد الناجح للمربعات المناسبة لجمع البيانات.
- تقليل زيغ الكوما من خلال المحاذاة الصحيحة.
الاستنتاجات
- يعد إمالة منصة العينات استراتيجية فعالة في المجهر الإلكتروني المبرد (cryo-EM).
- يمكن لهذه الطريقة أن تحسن جودة خرائط المجهر الإلكتروني بشكل كبير.
- قد تعمل التطبيقات المستقبلية على تطوير تقنيات جمع البيانات بشكل أكبر.
الأسئلة الشائعة
الأهمية التنفيذية في الصناعة
يعالج المجهر الإلكتروني المبرد (cryo-EM) للجسيمات الفردية مع إمالة المنصة عنق زجاجة حرج في البيولوجيا البنيوية من خلال التغلب على التوجه التفضيلي للجسيمات، والذي يمكن أن يحد من القدرة على تفسير الخريطة ودقتها. وتعزز هذه القدرة الثقة التنبؤية في تحديد البنية الجزيئية الكبيرة، مما يؤثر بشكل مباشر على نقاط التحول في الاكتشاف المبكر والتحقق من الأهداف. ويتوافق هذا النهج بشكل واسع مع منصات المجهر الإلكتروني النافذ (TEM) القياسية، مما يدعم جمع بيانات قابلة للتطوير والتكرار عبر محافظ البحث والتطوير في مجال الأدوية البيولوجية.
التطبيقات الاستراتيجية في البحث والتطوير في مجال الأدوية الحيوية
الاكتشاف المبكر والتحقق من الهدف
- يتيح استقصاءً بنيوياً شاملاً للأهداف الجزيئية الكبيرة من خلال تحسين توزيع التوجيه.
- يقلل من الغموض الميكانيكي في التحقق من الأهداف من خلال دقة الخرائط متماثلة المناحي.
- يدعم الثقة التنبؤية لتصميم الأدوية القائم على البنية وفرز محفظة الأدوية.
الفحص وتطوير المقايسة
- يجهز مجموعات بيانات هيكلية مُصادق عليها لسير عمل الحوسبة والفرز اللاحقة.
- يسهل التقييم الكمي والقابل للتكرار لتوزيعات الجزيئات عبر الظروف المختلفة.
- يتيح التقييم الموثوق لبروتوكولات تحضير العينات وجودة الشبكة.
الأبحاث الانتقالية وما قبل السريرية
- يعزز الاستمرارية من مرحلة الاكتشاف إلى التحقق قبل السريري من خلال توفير بيانات هيكلية عالية الجودة.
- يدعم قرارات المضي قدماً المعدلة حسب المخاطر من خلال تحسين إمكانية تفسير الخرائط.
- يتماشى مع استراتيجيات المؤشرات الحيوية الانتقالية عندما تساهم الرؤى الهيكلية في توجيه المقايسات الوظيفية.
تكامل خطوط المعالجة وسير العمل
تتكامل عملية جمع بيانات المجهر الإلكتروني المبرد (cryo-EM) ذات المنصة المائلة في التسلسل الممتد من مرحلة الاكتشاف إلى المرحلة قبل السريرية، وذلك من خلال تمكين التوصيف البنيوي القوي في المراحل المبكرة والمتوسطة من مسار التطوير.
- بيولوجيا الاكتشاف: تعزز قدرة اختبار الفرضيات من خلال تقليل انحياز التوجه وتوضيح البنية الجزيئية الكبيرة.
- الفحص: تقدم توزيعات توجيه كمية وقابلة للتكرار لضمان جاهزية المقايسة وتوحيد المنهجية.
- التحليلات: توفر خرائط متناحية عالية الجودة للتحليل المقارن وتحسين الظروف.
- الأبحاث الانتقالية: تدعم الاستمرارية في المرحلة قبل السريرية من خلال ضمان موثوقية البيانات البنيوية للتطبيقات اللاحقة.
- إعادة الاستخدام المؤسسي: توفر سير عمل قابل للتعميم ومتوافق مع المعدات للاستخدام المتكرر عبر أهداف ومشاريع متنوعة.
التأثير التشغيلي والمؤسسي
- القيمة العلمية: تعزز الثقة التنبؤية وتقلل من الغموض الهيكلي في التحقق من الأهداف.
- القيمة التشغيلية: توحد عملية جمع البيانات، وتزيد من قابلية التكرار، وتتوافق مع البنية التحتية الحالية لـ TEM.
- القيمة الاستراتيجية: تحسن جودة قرارات المضي قدماً أو التوقف (go/no-go) وتقلل من المخاطر في المراحل المتأخرة من خلال توفير أدلة هيكلية قوية.
- التأثير على المحفظة: تتيح تحديد الأولويات المعدلة حسب المخاطر والنهوض بالأهداف التي تم التحقق منها هيكلياً.
اعتبارات التنفيذ
- يتطلب خبرة في محاذاة المجهر الإلكتروني المبرد (cryo-EM) والتعامل مع العينات.
- يتطلب الوصول إلى مجاهر TEM قياسية وبرمجيات Leginon للاقتناء الآلي.
- يستلزم توحيد معايير تحضير الشبكات وبروتوكولات جمع البيانات بين الفرق المختصة.
- قابل للتطبيق على مجموعة متنوعة من العينات الجزيئية الكبيرة وأنواع الشبكات.
- يجب مراقبة وتقليل احتمالية التكدس عند زوايا الإمالة العالية.
