فك رموز منظمة كروماتين 3D عالية الدقة عبر التقاط Hi-C

يسمح Capture Hi-C بفك تشفير تنظيم الكروماتين 3D للمنطقة الجينومية ذات الحجم الضخم ذات الأهمية بدقة عالية. مع Capture Hi-C ، يتم تحقيق دقة أعلى وخصوصية الأليل مع تحسين فعالية الوقت والقدرة على تحمل تكاليف التقنية. من المرجح أن يسهل تطبيق Capture IC على نظام نموذجي مختلف وأنواع الخلايا والمناظر الطبيعية للكروماتين المنظمة تنمويا في الظروف الصحية والمرضية فهمنا للتفاعل بين طوبولوجيا الجينوم وتنظيم الجينات.

للبدء ، قم بالتريبتونيز وعد الخلايا من لوحة التحكم المعدة خصيصا لعد الخلايا باستخدام عداد الخلايا الآلي. قم بتضمين تلطيخ الجدوى لتحديد النسبة المئوية للخلايا القابلة للحياة. من عدد الخلايا هذا ، قم بتقدير العدد الإجمالي للخلايا في اللوحة المعدة للربط المتشابك.

قم بإزالة وسط الاستزراع من الألواح المعدة للتشابك واستبدله بمحلول التثبيت. ثبت لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة تحت خلط لطيف على شاكر. إخماد التفاعل الثابت بإضافة 2.5 مولار جليكاين PBS إلى تركيز نهائي قدره 0.125 مولاس.

أضف 530 ميكرولترا من 2.5 مولار جليكاين PBS إلى 10 ملليلتر في لوحة 10 سم. احتضان لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة ، مع خلط بلطف على شاكر. انقل الأطباق إلى الثلج واحتضانها لمدة 15 دقيقة إضافية على الثلج مع الخلط برفق على شاكر.

قم بإزالة محلول التثبيت من الخلايا عن طريق سكبه في دورق لضمان التعامل السريع. شطف لوحة 10 سم بسرعة مرتين مع خمسة ملليلتر من البرد 0.125 مولار جليكاين PBS لغسل الحطام والخلايا الميتة. قم بإزالة السائل من اللوحة عن طريق سكبه في دورق لضمان التعامل السريع.

أضف خمسة ملليلتر من البرد 0.125 مولار جليكاين PBS إلى لوحة 10 سم. وكشط الخلايا بسرعة من اللوحة باستخدام مكشطة الخلايا البلاستيكية. انقل تعليق الخلية إلى أنبوب طرد مركزي مخروطي التبريد مسبقا سعة 50 ملليلتر باستخدام ماصة مصلية.

شطف لوحة مرتين مع خمسة ملليلتر من البرد 0.125 مولي جليكاين PBS وإضافة تعليق الخلية إلى أنبوب الطرد المركزي المخروطي. تدور لأسفل عند 480 جم لمدة 10 دقائق عند أربع درجات مئوية. قم بإزالة المادة الطافية عن طريق الشفط باستخدام نظام شفط منضدة.

إعادة تعليق الخلايا و aliquot 500 ميكرولتر من تعليق الخلية في العدد المحسوب من أنابيب الطرد المركزي الصغيرة 1.5 ملليلتر. قم بتدويرها عند 480 مرة G لمدة 10 دقائق عند أربع درجات مئوية وقم بتخزين كريات الخلايا الجافة عند 80 درجة مئوية. لتحلل الخلايا ، قم بإذابة الكريات المجمدة على الجليد.

تحضير 1.5 ملليلتر من العازلة تحلل في الماء. أضف 600 ميكرولتر من محلول التحلل البارد وأعد تعليقه جيدا على الجليد. قم بتدويره عند 2،655 جم لمدة خمس دقائق عند أربع درجات مئوية وقم بإزالة المادة الطافية باستخدام نظام شفط فوق الطاولة.

إعادة التعليق في 100 ميكرولتر من 0.5٪ SDS. بعد الحضانة عند 62 درجة مئوية تدور عند 1400 دورة في الدقيقة لمدة 10 دقائق ، أضف 290 ميكرولترا من الماء بالإضافة إلى 50 ميكرولترا من 10٪ Triton X 100 ، واخلطها جيدا ، وتجنب فقاعات الهواء. احتضان عند 37 درجة مئوية مع الدوران عند 1400 دورة في الدقيقة لمدة 10 دقائق قبل إضافة 50 ميكرولتر من 10 X DPN أنبوب المخزن المؤقت وعكس الأنبوب للخلط.

خذ 50 ميكرولترا من الحمض النووي غير المهضوم لمراقبة الجودة في أنبوب منفصل. لا تنس أن تأخذ عينة التحكم غير المهضومة. لهضم DPN2 ، أضف 10 ميكرولتر من تركيز DPN2 العالي واخلطه عن طريق التقليب.

احتضان العينات والتحكم غير المهضوم في خلاط حراري عند 37 درجة مئوية ، والدوران بسرعة 1400 دورة في الدقيقة لأكثر من أربع ساعات. للربط وعكس الربط المتقاطع ، خذ 50 ميكرولترا من الحمض النووي المهضوم المربوط لمراقبة الجودة في أنبوب منفصل. قم بتخزين أدوات التحكم غير المهضومة وغير المربوطة عند 20 درجة مئوية.

أضف 800 ميكرولتر من كوكتيل الربط. احتضان عند 16 درجة مئوية ، وتدور في 1000 دورة في الدقيقة بين عشية وضحاها. لتنقية الحمض النووي ، انقل العينات الموجودة على الجليد إلى أنابيب طرد مركزي مخروطية 15 ملليلتر مسبقة التبريد وأضف ملليلتر من الماء ، و 10.5 ملليلتر من الإيثانول البارد المثلج ، و 583 ميكرولترا من ثلاثة أسيتات الصوديوم المولية.

أضف 200 ميكرولتر من الإيثانول البارد المثلج ، و 10.8 ميكرولتر من أسيتات الصوديوم ، وميكرولتر واحد من coprecipitant إلى ضوابط الجودة غير المهضومة والمرتبطة. احتضان في ناقص 80 درجة مئوية لمدة أربع ساعات على الأقل حتى بين عشية وضحاها. قم بتدوير الأنابيب سعة 15 ملليلتر عند 2200 جم عند أربع درجات مئوية لمدة 45 دقيقة.

قم بإزالة الإيثانول بعناية وجفف العينات وأدوات التحكم في الهواء في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 إلى 15 دقيقة. لا تفرط في الجفاف. أعد تعليق العينات والضوابط في 100 ميكرولتر و 20 ميكرولتر من الماء ، على التوالي.

لمراقبة جودة إعداد قالب 3C ، قم بتحميل 100 إلى 200 نانوجرام من كل عينة وكل عنصر تحكم على هلام 1٪ agros 1XTBE. ثم لإجراء التخصيب المستهدف لتسلسل تعدد الإرسال النهائي المقطوع ، خذ أربعة ميكروغرامات من قالب 3C ، وأعد تعليقه في 130 ميكرولترا من الماء لكل تفاعل التقاط. قم بتنشيط العينة واستمر في التحضير بثلاثة ميكروغرام من الحمض النووي المنفصم.

لتهجين عينات الحمض النووي المحضرة إلى مجسات الحمض النووي الريبي الخاصة بالهدف ، استخدم 750 نانوجرام من عينات الحمض النووي في حجم نهائي يبلغ 3.4 ميكرولتر ، مما ينتج عنه تركيز أولي قدره 221 نانوجرام لكل ميكرولتر. استخدم تركيز فراغ السرعة إذا لزم الأمر لتحقيق الحجم النهائي البالغ 3.4 ميكرولتر. بالنسبة للعينات التي يتم تعليقها في 10 ميكرولتر ، يكفي التركيز من 15 إلى 20 دقيقة.

احتضان خليط التهجين لمدة 16 إلى 18 ساعة عند 65 درجة مئوية بغطاء ساخن عند 105 درجة مئوية ، وفقا لتعليمات الشركة الصانعة. لالتقاط شظايا الربط المستهدفة ، أضف الستربتيفيد في حبات مقترنة إلى العينة المهجنة للمسبار. وأخيرا، لإعداد العينات لتسلسل تعدد الإرسال، استمر في البروتوكول وفقا لنظام الإثراء المستهدف المستخدم في هذه الدراسة للتسلسل المزدوج والمتعدد.

تسمح دقة خريطة تفاعل Capture Hi-C بتحديد مجالين أصغر في Tsix-tad الذي يحتوي على مروج موضع Tsix. لم يتحقق هذا من قبل مع 5C. علاوة على ذلك ، فإن الهياكل الفرعية الأخرى ، مثل حلقات الاتصال ، مرئية بوضوح من بيانات Capture Hi-C ، مثل الحلقة بين Xist و FTX ، التي تم تحديدها مسبقا مع Capture C والحلقة بين Xist و Xert التي تم تحديدها مؤخرا باستخدام بروتوكول مماثل ل Capture Hi-C.

يمكن أيضا تعيين جهات الاتصال الأخرى بشكل أكثر دقة نظرا لزيادة دقة ملفات تعريف Capture Hi-C ، مثل تلك التي تشكل نقاط الاتصال المعروفة داخل Tsix-tad بين مواقع Linx و Chic1 و Xite. بالمقارنة مع بيانات Hi-C المعروضة ، سمح Capture Hi-C بزيادة أربعة أضعاف في الدقة ، ومع ذلك فقد تطلب ربع عمق التسلسل فقط. من المهم جدا ألا تنسى أخذ 50 ميكرولترا من عينات الحمض النووي غير المهضومة وغير المربوطة كمراقبة جودة لإعداد قالب 3C.