إنشاء مفصل الركبة على رقاقة لنمذجة أمراض المفاصل واختبار الأدوية

إن قدرتنا على التنبؤ بدقة بكيفية استجابة البشر للأدوية أثناء التجارب السريرية محدودة بسبب عدم وجود نماذج قبل سريرية ذات صلة من الناحية الفسيولوجية. يمكن لهذا النظام الفيزيولوجي الدقيق معالجة هذا التفاوت. يحاكي هذا النظام المشتق من الخلايا البشرية بدقة طبيعة مرض المفاصل الكاملة لالتهاب المفاصل في الركبة البشرية ، مما يسمح باختبار أدوية هشاشة العظام المعدلة للمرض قبل التجارب السريرية ، مما قد يوفر ملايين الدولارات.

ابدأ في تحضير الجيلاتين الميثاتكريليت ، أو GelMA ، بإضافة 17 جراما من الجيلاتين من النوع B إلى 500 مل من الماء المقطر. امزجه لمدة 30 دقيقة على شاكر عند 37 درجة مئوية وأضف 13 ملليلترا من أنهيدريد الميثاكريليك قبل الخلط طوال الليل على شاكر. في اليوم التالي ، قم بإعداد حوالي 60 ملليلتر من حصص GelMA في أكياس غسيل الكلى.

ضع جميع أكياس غسيل الكلى في ماء مقطر بقضيب تقليب لمدة سبعة أيام. قم بتغيير الماء عدة مرات في اليوم واترك الأكياس عند أربع درجات مئوية طوال الليل. في اليوم السابع ، صب GelMA في طبق وقم بتجميده عند 80 درجة مئوية تحت الصفر قبل التجفيد.

بعد ذلك ، قم بتجفيف GelMA بالتجميد عن طريق وضعه في غرفة التفريغ في مجفف التجميد. تأكد من التجفيف الكامل قبل الإزالة من مجفف التجميد. بعد ذلك ، قم بإذابة GelMA المجفف بالتجميد في محلول ملح Hanks المتوازن بتركيز 15٪ واضبط الرقم الهيدروجيني على 7.4 باستخدام كمية صغيرة من هيدروكسيد الصوديوم.

بناء على الحجم المكتسب ، استكمل المحلول بمضادات حيوية و 0.15٪ فوسفات فينيل فينيل الليثيوم ، أو LAP. احم محلول GelMA من الضوء وقم بتخزينه في درجة حرارة 20 درجة مئوية تحت الصفر حتى الاستخدام مرة أخرى. الأوتوكلاف 3D طبع غرف المفاعل الحيوي ثنائي التدفق ، والأغطية ، وإدراج في أكياس الأوتوكلاف عند 121 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة مع البخار.

وبعد ذلك ، لمدة 20 دقيقة مع الحرارة الجافة. بعد التعقيم ، انقع غرف المفاعل الحيوي والأغطية والإدخالات في 15 ملليلترا من برنامج تلفزيوني معقم طوال الليل داخل خزانة السلامة الحيوية ، متبوعا بالتجفيف الكامل. باستخدام ماصة 1000 ميكرولتر ، أعد تعليق 20 مرة 10 إلى الخلايا الجذعية الوسيطة المشتقة من نخاع العظم البشري السادس ، أو MSCs ، لكل خلية ملليلتر في محلول GelMA بنسبة 15٪.

ثم اضغط على قالب سيليكون معقم وجاف على طبق بتري ، باستخدام قفازات معقمة. ضع ملحقا واحدا في كل فتحة من قالب السيليكون باستخدام ملقط بحيث يكون جانب فتحة الملحق متجها لأسفل. بمجرد الانتهاء من ذلك ، أضف حوالي 50 ميكرولترا من تعليق الخلية لكل ملحق باستخدام ماصة 200 ميكرولتر.

قم بربط الجل داخل الملحق عن طريق تعريض الجزء العلوي لمصباح يدوي للأشعة فوق البنفسجية بطول موجة 395 نانومتر لمدة 1.5 دقيقة ، ثم إضاءة الجانب الآخر لمدة 30 ثانية. باستخدام ملقط معقم ، قم بنقل الإدخالات على الفور إلى ثمانية ملليلتر من وسط النمو في ستة ألواح بئر غير منسجية والسماح للخلايا بالتعافي بين عشية وضحاها. لبدء تمايز الأنسجة الدهنية ، انقل الحشوات إلى ثمانية ملليلتر من الوسط الدهني واستزرعها لمدة 28 يوما مع تغيير متوسط يومي.

لهندسة وحدات العظم الغضروفي ، ضع الإدخالات في غرف مفاعل حيوي مزدوج التدفق ، وقم بتغطية الآبار ، وغرس التيارين بشكل منفصل بمعدل تدفق يبلغ خمسة ميكرولتر في الدقيقة مع 35 ملليلتر من الوسط العظمي و 35 ملليلتر من الوسط الغضروفي المنشأ. الحفاظ على الخلايا للتمايز لمدة 28 يوما عن طريق إجراء تغييرات حقنة كل أسبوعين مع الأنواع المتوسطة المعنية. لاشتقاق الخلايا الليفية ، قم بتمييز MSCs في ثقافة 2D في قارورة زراعة خلايا الأنسجة T 150 سم مربع تحتوي على 20 ملليلتر من الوسط الليفي لمدة 21 يوما.

الحفاظ على التغيير الأسبوعي للوسيط. بعد 21 يوما ، استخدم أربعة ملليلتر من التربسين لفصل الخلايا. تغليف المواد الهلامية 3D داخل إدراج.

للحصول على نسيج ليفي يشبه الزليلي ، أو SFT ، اتبع بروتوكولا مشابها. قم بتوصيل أنبوب السيليكون ، الذي يبلغ قطره الداخلي 0.062 بوصة وقطره الخارجي 0.125 بوصة ، بقضيب المفاعل الحيوي الصغير في أحد طرفيه وموصلات قفل الإغراء F 1/16 في الطرف الآخر. ثم ، الأوتوكلاف المفاعلات الحيوية الصغيرة 3D جنبا إلى جنب مع أنابيب السيليكون والأغطية.

تحضير وتحميل 35 ملليلتر من الوسط لاستخدامها في الاستزراع المشترك الصغير في الخزانات المتوسطة. استخدم ملقط مستقيم لنقل وحدات العظم الغضروفي من المفاعل الحيوي ثنائي التدفق إلى البئر الأيمن للمفاعل الحيوي الصغير. نقل إدراج الأنسجة الدهنية وإدخال الأنسجة الليفية في الآبار اليسرى والوسطى ، على التوالي ، قبل تغطية جميع الآبار بأغطية معقمة.

قم بتوصيل مداخل المشبك الصغيرة بالخزانات المتوسطة والمنافذ بالمحاقن. ثم قم بتركيب المحاقن على مضخة حقنة. نقل المضخة والرقائق إلى حاضنة.

ضع الخزانات المتوسطة على الجليد خارج الحاضنة. قم بتشغيل المضخة في وضع السحب ، وسحب الوسط من الخزان المتوسط إلى غرفة المفاعل الحيوي الصغير. استمر في عملية الاستزراع المشتركة المصغرة هذه لمدة 28 يوما.

لنمذجة التهاب المفاصل وتنكس الغضروف ، أضف إنترلوكين بيتا واحد إلى السلالة المتوسطة الليفية عند 10 نانوجرام لكل ملليلتر لمدة سبعة أيام. تأكد من استبدال المحقنة في اليوم الثالث قبل تقديم إنترلوكين واحد بيتا طازج إلى الوسط الليفي. لاختبار الدواء ، بعد ثلاثة أيام من العلاج بيتا واحد من إنترلوكين ، يتم إعطاء الدواء إما في الوسط المشترك ، أو محاكاة الإدارة داخل المفصل ، أو في جميع الأنواع المتوسطة ، ومحاكاة الإدارة الجهازية.

بعد سبعة أيام من علاج إنترلوكين بيتا واحد ، اجمع الأنسجة الفردية للتحليل. بعد إزالة الحشوات باستخدام ملقط معقم ، ادفع لكمة خزعة عبر مركز الملحق لإزالة الجل ووضع الجل في برنامج تلفزيوني. بعد ذلك ، قم بقطع المواد الهلامية العظمية الغضروفية إلى النصف أثناء تقييم التعبير الجيني.

جمع وطرد مركزي حوالي 1.5 ملليلتر من الوسائط من كل مصدر وسيط في 14،000 غرام لمدة 10 دقائق. بعد التخلص من الرواسب ، قم بتجميد الوسائط المكيفة في النيتروجين السائل. بالنسبة للتلطيخ النسيجي والتلوين المناعي ، أولا ، قم بإصلاح الأنسجة الليفية العظمية الغضروفية والشبيهة بالزليلي ، أو عينات SFT ، في 10٪ من الفورمالين المخزن وتجفيفها في الإيثانول بتركيزات تصاعدية.

امسح العينة في الزيلين ، وقم بتضمينها في البارافين ، وأخيرا ، قسم العينات إلى سمك ستة ميكرومتر. في حالة الأنسجة الدهنية ، قم بتلطيخ العينات الرسمية والثابتة المخزنة بنسبة 10٪ مباشرة ، بمحلول O الأحمر الزيتي أو BODIPY. تم الحفاظ على الأنماط الظاهرية الخاصة بالأنسجة بشكل جيد للأنسجة الدقيقة الفردية.

تم جمع جميع أنسجة المفصل الصغير لتحليل أنماطها الظاهرية بعد 28 يوما من الثقافة. أعرب المكون العظمي للأنسجة الدقيقة لوحدات العظم الغضروفي عن مستويات عالية من أوستيوكالسين. في الجزء الغضروفي من العظم الغضروفي ، أعربت الأنسجة عن مستويات عالية بشكل ملحوظ من الكولاجين من النوع الثاني و aggrecan.

كانت مستويات التعبير عن الجينات الدهنية التمثيلية ، الأديبونيكتين ، واللبتين أعلى في الأنسجة الدهنية. شوهد ترسب معادن الكالسيوم والفوسفاتيز القلوي وبروتين أوستيوكالسين في المقام الأول في حجم العظام للأنسجة الدقيقة العظمية الغضروفية. أظهر جانب الغضروف من الأنسجة العظمية الغضروفية الجليكوزامينوجليكان والكولاجين من النوع الثاني المحتفظ به جيدا.

تم تنظيم التعبير عن العلامات المرتبطة بتضخم الخلايا الغضروفية ، الكولاجين من النوع 10 والقنفذ الهندي ، بشكل كبير بعد 28 يوما من الثقافة. تم العثور على ترسب قطرات الدهون وفيرة في الأنسجة الدهنية. أظهر التلوين المناعي تعبيرا قويا عن مادة التشحيم والكاديرين 11 بواسطة SFT بعد أربعة أسابيع من الثقافة.

في نموذج المرض ، أدى علاج IL one beta إلى موت الخلايا المبرمج وارتفاع مستويات MMP-13 في SFT. تم علاج تدهور الغضروف بواسطة IL one beta ، مما يشير إلى حدوث تداخل بين الأنسجة العظمية الغضروفية و SFT. أظهرت الفعالية العلاجية للنابروكسين من خلال الإدارة الجهازية انخفاض تدهور الغضروف في IL واحد بيتا ميني joint.

أشار تفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الفعلي إلى أن الأدوية الأربعة المحتملة لتعديل هشاشة العظام عكست جزئيا فقدان الغضروف. تتضمن أهم خطوات هذا الإجراء الربط المتقاطع للمواد الهلامية في الإدخالات ووضع الإدخال في المفاعل الحيوي. تسمح الرقاقة بالتحقيق في مساهمة عوامل الخطر الأخرى المقدمة في هشاشة العظام ، مثل السمنة والإصابات الميكانيكية.

ويمكن أيضا أن تستخدم لدراسة أمراض المفاصل الأخرى.