في الجسم الحي تصوير الكالسيوم واسع المجال وثنائي الفوتون من فأر باستخدام نافذة جمجمة كبيرة

يظهر هذا البروتوكول إنشاء نافذة جمجمة كبيرة لقياس أنشطة الحجز واسعة المجال والخلية الواحدة في نفس الماوس. باستخدام طريقتنا ، يمكن صنع نافذة جمجمة كبيرة ومستقرة مع غلاف الطعام بتكلفة منخفضة. هذه الطريقة فعالة لدراسة الأنشطة العصبية والدبقية أثناء السلوك على المستويات العيانية والمجهرية.

من المستحسن أن تبدأ مع نافذة صغيرة في الجمجمة. ثم إذا نجحت ، فقم بزيادة حجم النافذة. ابدأ بإزالة الأسمنت الزائد فوق الجمجمة باستخدام مثقاب الأسنان.

ضع علامة على المنطقة المراد قطعها بقلم. قطع في العظام باستخدام مشرط مع طرف حاد للتأكد من أن الطرف لا يخترق الجمجمة. كشط العظم بشكل متكرر بمشرط لتعميق الأخدود حتى يتحرك العظم في المنطقة المراد قصها عند لمسها برفق.

قم بإزالة العظم المقطوع بملاقط دقيقة. كن حذرا حتى لا تدفع سديلة العظام إلى الدماغ مما قد يؤدي إلى تلف الدماغ. لإزالة الأم الجافية ، قم بقطع الجافية باستخدام ماصة زجاجية مسحوبة بطرف مدبب يبلغ حوالي 10 ميكرومتر.

استخدم إبرة على شكل حرف U لتوسيع هذا القطع على النافذة بأكملها. تحت مجهر ستيريو مضبوط على تكبير 60 إلى 100x ، قم بإزالة الأم الجافية المقطوعة بملاقط فائقة الدقة. في حالة النزيف، اشطفه باستخدام السائل الدماغي النخاعي أو استخدم إسفنجة الجيلاتين لوقف النزيف.

بعد ذلك ، قم بتعقيم قطعة كبيرة من غلاف PVDC عن طريق التعقيم وبنسبة 70٪ من الإيثانول. تحت مجهر ستيريو ، استخدم ملاقط ومشرط لقطع غلاف بالحجم المطلوب. ضع الغلاف على سطح الدماغ مع ترك السائل الدماغي النخاعي على السطح.

قم بامتصاص aCSF من حافة الغلاف ، مما يسمح للغلاف بالالتصاق بقوة بسطح الدماغ. تقليم التفاف مع مشرط وملاقط بحيث يكون هناك ما يقرب من هامش ملليمتر واحد بين حافة نافذة الجمجمة والتفاف. بمجرد وضع الغلاف في مكانه ، قم بلصق حافة الغلاف على الجمجمة بمادة لاصقة بيولوجية.

اترك المادة اللاصقة تجف لمدة 30 دقيقة. باستخدام موزع بطرف خلط ، ضع مطاطا صناعيا شفافا من السيليكون أعلى الغلاف. ضع غطاء الزجاج بسمك 0.12 إلى 0.17 ملم في الأعلى.

أغلق محيط زجاج الغطاء بغشاء مقاوم للماء أو غراء فائق أو أسمنت أسنان. أولا ، امزج محاليل الفبروين و AAV بنسبة واحد إلى أربعة في أنبوب عينة صغير. قم بإسقاط حصة من المحلول على الغلاف البلاستيكي لنافذة الجمجمة وجففها لمدة ثلاث ساعات على الأقل.

ثم قم بتوصيل الغلاف بسطح الدماغ كما هو موضح في القسم السابق. تحقق من حالة الفئران والنوافذ بانتظام ، من أسبوعين إلى أربعة أسابيع. بحلول هذا الوقت ، سيتم التعبير عن مؤشرات الكالسيوم المشفرة وراثيا بشكل كاف بعد إنشاء النافذة المعالجة ب AAV.

باستخدام هذا البروتوكول ، يمكن الحفاظ على نوافذ الجمجمة في ثمانية من 10 فئران لمدة تصل إلى 10 أسابيع. يتم إنشاء نافذة واسعة مع غلاف بلاستيكي ، سيليكون شفاف ، وغطاء زجاجي في فأر معدل وراثيا يعبر عن مؤشر الكالسيوم المشفر وراثيا في الخلايا النجمية. تم إجراء تصوير الكالسيوم واسع المجال من خلال هذه النافذة ولوحظت تغيرات مضان عندما تم تطبيق تحفيز نفخة الهواء على الشعيرات المقابلة.

أظهر المسار الزمني لتغيير التألق في القشرة الحسية الجسدية نشاطا قشريا. سمح التصوير ثنائي الفوتون بمراقبة صور مضان الخلية المفردة الخاصة بالخلايا الدبقية. لوحظت تغيرات مضان ناجمة عن التحفيز الحسي في الخلايا الفردية من مناطق قشرية مختلفة.

التفاف مشفر مع AAV معبرا عن مؤشر الكالسيوم المشفر وراثيا ؛ و تم استخدام الفبروين لصنع نافذة الجمجمة. أظهر تصوير الكالسيوم واسع المجال نشاطا قشريا ينتشر عبر القشرة الناجم عن التحفيز الحسي بعد أسبوعين إلى أربعة أسابيع من الجراحة. نظرا لأن النافذة كانت كبيرة ، فقد تم تصوير مناطق قشرية مختلفة من نفس الفأر وشوهدت تغيرات مضان ناتجة عن التحفيز الحسي في الخلايا الفردية.

من المهم تجنب تلف الدماغ عند صنع نافذة الجمجمة. يمكن للمرء أداء مهام السلوك على الفئران مع نافذة الجمجمة الكبيرة. سيسمح ذلك بفحص العلاقة بين النشاط العصبي وسلوك الفأر.

يمكن تطبيق هذه الطريقة على مجموعة متنوعة من دراسات علم الأعصاب. على سبيل المثال ، يمكن استخدامه لمراقبة النشاط القشري أثناء مهام صنع القرار ، والجري الحركي ، وفي النماذج الجماعية لإصابات الدماغ والمرض.