Name: إكس فيفو تحليل عابرات الكالسيوم2+ المنشطة ميكانيكيا في خلايا الظهارة البولية (فيديو) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-09-28T14:50:00.000+00:00
Duration: 5 min 35 s
Description: اكتشف تقنية تحليل عابرات الكالسيوم المنشطة ميكانيكياً في خلايا الظهارة البولية خارج الجسم باستخدام مستشعر GCaMP5G. تساعد هذه الطريقة الباحثين على دراسة قنوات الأيونات المنشطة ميكانيكياً.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

تم دعم هذا العمل من خلال منح المعاهد الوطنية للصحة R01DK119183 (إلى GA و MDC) و S10OD028596 (إلى GA) ومن قبل فسيولوجيا الخلية والكائنات الحية النموذجية لتصوير الكلى من مركز بيتسبرغ لأبحاث الكلى (P30DK079307).

<ol><li>Kunau, R. T., Webb, H. L., Borman, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characteristics+of+the+relationship+between+the+flow+rate+of+tubular+fluid+and+potassium+transport+in+the+distal+tubule+of+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Characteristics of the relationship between the flow rate of tubular fluid and potassium transport in the distal tubule of the rat.</a> Journal of Clinical Investigation. 54 (6), 1488-1495 (1974).</li>
<li>Engbretson, B. G., Stoner, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow-dependent+potassium+secretion+by+rabbit+cortical+collecting+tubule+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Flow-dependent potassium secretion by rabbit cortical collecting tubule in vitro.</a> American Journal of Physiology. 253 (5), 896-903 (1987).</li>
<li>Satlin, L. M., Sheng, S., Woda, C. B., Kleyman, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epithelial+Na%28%2B%29+channels+are+regulated+by+flow%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology+Renal+Physiology%22%5BJournal%5D)">Epithelial Na(+) channels are regulated by flow.</a> American Journal of Physiology Renal Physiology. 280 (6), 1010-1018 (2001).</li>
<li>Woda, C. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ontogeny+of+flow-stimulated+potassium+secretion+in+rabbit+cortical+collecting+duct%3A+functional+and+molecular+aspects%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology+Renal+Physiology%22%5BJournal%5D)">Ontogeny of flow-stimulated potassium secretion in rabbit cortical collecting duct: functional and molecular aspects.</a> American Journal of Physiology Renal Physiology. 285 (4), 629-639 (2003).</li>
<li>Malnic, G., Berliner, R. W., Giebisch, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+dependence+of+K%2B+secretion+in+cortical+distal+tubules+of+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Flow dependence of K+ secretion in cortical distal tubules of the rat.</a> American Journal of Physiology. 256 (5), 932-941 (1989).</li>
<li>Khuri, R. N., Strieder, W. N., Giebisch, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+flow+rate+and+potassium+intake+on+distal+tubular+potassium+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Effects of flow rate and potassium intake on distal tubular potassium transfer.</a> American Journal of Physiology. 228 (4), 1249-1261 (1975).</li>
<li>Good, D. W., Wright, F. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Luminal+influences+on+potassium+secretion%3A+sodium+concentration+and+fluid+flow+rate%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Luminal influences on potassium secretion: sodium concentration and fluid flow rate.</a> American Journal of Physiology. 236 (2), 192-205 (1979).</li>
<li>Wong, K. R., Berry, C. A., Cogan, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+dependence+of+chloride+transport+in+rat+S1+proximal+tubules%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Flow dependence of chloride transport in rat S1 proximal tubules.</a> American Journal of Physiology. 269 (6), 870-875 (1995).</li>
<li>Garvin, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glucose+absorption+by+isolated+perfused+rat+proximal+straight+tubules%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Glucose absorption by isolated perfused rat proximal straight tubules.</a> American Journal of Physiology. 259 (4), 580-586 (1990).</li>
<li>Malnic, G., Klose, R. M., Giebisch, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micropuncture+study+of+renal+potassium+excretion+in+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Micropuncture study of renal potassium excretion in the rat.</a> American Journal of Physiology. 206 (4), 674-686 (1964).</li>
<li>Malnic, G., Klose, R. M., Giebisch, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micropuncture+study+of+distal+tubular+potassium+and+sodium+transport+in+rat+nephron%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Micropuncture study of distal tubular potassium and sodium transport in rat nephron.</a> American Journal of Physiology. 211 (3), 529-547 (1966).</li>
<li>Cabral, P. D., Garvin, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Luminal+flow+regulates+NO+and+O2%28-%29+along+the+nephron%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Luminal flow regulates NO and O2(-) along the nephron.</a> American Journal of Physiology. 300 (5), 1047-1053 (2011).</li>
<li>Raghavan, V., Rbaibi, Y., Pastor-Soler, N. M., Carattino, M. D., Weisz, O. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shear+stress-dependent+regulation+of+apical+endocytosis+in+renal+proximal+tubule+cells+mediated+by+primary+cilia%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Shear stress-dependent regulation of apical endocytosis in renal proximal tubule cells mediated by primary cilia.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (23), 8506-8511 (2014).</li>
<li>Lewis, S. A., de Moura, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apical+membrane+area+of+rabbit+urinary+bladder+increases+by+fusion+of+intracellular+vesicles%3A+an+electrophysiological+study%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Membrane+Biology%22%5BJournal%5D)">Apical membrane area of rabbit urinary bladder increases by fusion of intracellular vesicles: an electrophysiological study.</a> The Journal of Membrane Biology. 82 (2), 123-136 (1984).</li>
<li>Fowler, C. J., Griffiths, D., de Groat, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+neural+control+of+micturition%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The neural control of micturition.</a> Nature Reviews Neuroscience. 9 (6), 453-466 (2008).</li>
<li>Dalghi, M. G., Montalbetti, N., Carattino, M. D., Apodaca, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+urothelium%3A+life+in+a+liquid+environment%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reviews%22%5BJournal%5D)">The urothelium: life in a liquid environment.</a> Physiological Reviews. 100 (4), 1621-1705 (2020).</li>
<li>Khandelwal, P., Abraham, S. N., Apodaca, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+biology+and+physiology+of+the+uroepithelium%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology+Renal+Physiology%22%5BJournal%5D)">Cell biology and physiology of the uroepithelium.</a> American Journal of Physiology Renal Physiology. 297 (6), 1477-1501 (2009).</li>
<li>Sachs, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stretch-activated+ion+channels%3A+what+are+they%5BTitle%5D)+AND+%22Physiology%22%5BJournal%5D)">Stretch-activated ion channels: what are they.</a> Physiology. 25 (1), 50-56 (2010).</li>
<li>Martinac, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanosensitive+ion+channels%3A+molecules+of+mechanotransduction%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Mechanosensitive ion channels: molecules of mechanotransduction.</a> Journal of Cell Science. 117 (12), 2449-2460 (2004).</li>
<li>Ranade, S. S., Syeda, R., Patapoutian, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanically+activated+ion+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Mechanically activated ion channels.</a> Neuron. 87 (6), 1162-1179 (2015).</li>
<li>Cox, C. D., Bavi, N., Martinac, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biophysical+principles+of+ion-channel-mediated+mechanosensory+transduction%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Biophysical principles of ion-channel-mediated mechanosensory transduction.</a> Cell Reports. 29 (1), 1-12 (2019).</li>
<li>Carattino, M. D., Sheng, S., Kleyman, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epithelial+Na%2B+channels+are+activated+by+laminar+shear+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Epithelial Na+ channels are activated by laminar shear stress.</a> Journal of Biological Chemistry. 279 (6), 4120-4126 (2004).</li>
<li>Ross, T. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrins+in+mechanotransduction%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Integrins in mechanotransduction.</a> Current Opinion in Cell Biology. 25 (5), 613-618 (2013).</li>
<li>Dieterle, M. P., Husari, A., Rolauffs, B., Steinberg, T., Tomakidi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrins%2C+cadherins+and+channels+in+cartilage+mechanotransduction%3A+perspectives+for+future+regeneration+strategies%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Reviews+in+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Integrins, cadherins and channels in cartilage mechanotransduction: perspectives for future regeneration strategies.</a> Expert Reviews in Molecular Medicine. 23, 14(2021).</li>
<li>Huveneers, S., de Rooij, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanosensitive+systems+at+the+cadherin-F-actin+interface%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Mechanosensitive systems at the cadherin-F-actin interface.</a> Journal of Cell Science. 126, 403-413 (2013).</li>
<li>Sun, Z., Guo, S. S., Fässler, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrin-mediated+mechanotransduction%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Integrin-mediated mechanotransduction.</a> Journal of Cell Biology. 215 (4), 445-456 (2016).</li>
<li>Hamill, O. P., Marty, A., Neher, E., Sakmann, B., Sigworth, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+patch-clamp+techniques+for+high-resolution+current+recording+from+cells+and+cell-free+membrane+patches.+Pfl%C3%BCgers+Archiv%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Improved patch-clamp techniques for high-resolution current recording from cells and cell-free membrane patches. Pflügers Archiv.</a> European Journal of Physiology. 391 (2), 85-100 (1981).</li>
<li>Akerboom, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+a+GCaMP+calcium+indicator+for+neural+activity+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Optimization of a GCaMP calcium indicator for neural activity imaging.</a> The Journal of Neuroscience. 32 (40), 13819-13840 (2012).</li>
<li>Akerboom, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetically+encoded+calcium+indicators+for+multi-color+neural+activity+imaging+and+combination+with+optogenetics%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Molecular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Genetically encoded calcium indicators for multi-color neural activity imaging and combination with optogenetics.</a> Frontiers in Molecular Neuroscience. 6, 2(2013).</li>
<li>Sun, X. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+GCaMPs+for+improved+tracking+of+neuronal+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Fast GCaMPs for improved tracking of neuronal activity.</a> Nature Communications. 4, 2170(2013).</li>
<li>Dalghi, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+roles+for+PIEZO1+and+PIEZO2+in+urothelial+mechanotransduction+and+lower+urinary+tract+interoception%5BTitle%5D)+AND+%22JCI+Insight%22%5BJournal%5D)">Functional roles for PIEZO1 and PIEZO2 in urothelial mechanotransduction and lower urinary tract interoception.</a> JCI Insight. 6 (19), 152984(2021).</li>
<li>Durnin, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+ex+vivo+bladder+model+with+detrusor+smooth+muscle+removed+to+analyse+biologically+active+mediators+released+from+the+suburothelium%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">An ex vivo bladder model with detrusor smooth muscle removed to analyse biologically active mediators released from the suburothelium.</a> The Journal of Physiology. 597 (6), 1467-1485 (2019).</li>
<li>Delmas, P., Coste, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechano-gated+ion+channels+in+sensory+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Mechano-gated ion channels in sensory systems.</a> Cell. 155 (2), 278-284 (2013).</li>
<li>Tavernarakis, N., Driscoll, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Degenerins.+At+the+core+of+the+metazoan+mechanotransducer%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+the+New+York+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Degenerins. At the core of the metazoan mechanotransducer.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 940 (1), 28-41 (2001).</li>
<li>Peyronnet, R., Tran, D., Girault, T., Frachisse, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanosensitive+channels%3A+feeling+tension+in+a+world+under+pressure%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Plant+Science%22%5BJournal%5D)">Mechanosensitive channels: feeling tension in a world under pressure.</a> Frontiers in Plant Science. 5, 558(2014).</li>
<li>Blount, P., Iscla, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Life+with+bacterial+mechanosensitive+channels%2C+from+discovery+to+physiology+to+pharmacological+target%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology+and+Molecular+Biology+Reviews%22%5BJournal%5D)">Life with bacterial mechanosensitive channels, from discovery to physiology to pharmacological target.</a> Microbiology and Molecular Biology Reviews. 84 (1), 00055(2020).</li>
<li>Booth, I. R., Miller, S., Müller, A., Lehtovirta-Morley, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+evolution+of+bacterial+mechanosensitive+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Calcium%22%5BJournal%5D)">The evolution of bacterial mechanosensitive channels.</a> Cell Calcium. 57 (3), 140-150 (2015).</li>
</ol>

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

جميع الكائنات الحية ، وعلى ما يبدو معظم أنواع الخلايا ، تعبر عن القنوات الأيونية التي تستجيب للمنبهات الميكانيكية20،33،34،35،36،37. تم تقييم وظيفة هذه القنوات التي يتم تنشيطها ميكانيكيا في الغالب باستخدام تقنية مشبك التصحيح. ومع ذلك ، نظرا لمشكلات إمكانية الوصول ، اقتصرت دراسات المشبك التصحيحي للقنوات الأيونية المنشطة ميكانيك...

تتعرض الخلايا الطلائية في المسالك البولية لقوى ميكانيكية أثناء انتقال الراشح البولي عبر النيفرون، ويضخ البول من الحوض الكلوي وينتقل عبر الحالبين لتخزينه في المثانة البولية. من المسلم به منذ فترة طويلة أن القوى الميكانيكية (مثل إجهاد القص والتمدد) التي تمارسها السوائل على الخلايا الظهارية التي تبطن المسالك البولية تنظم إعادة امتصاص البروتين في النبيب القريب والمواد المذابة في النيفرون البعيد1،2،3،4،5،6،7،8،9،10،11 ، 12,13 ، وكذلك تخزين البول في المثانة البولية والتبول14,15,16,17.
يتم تحويل المحفزات الميكانيكية إلى إشارات كهربائية وكيميائية حيوية ، وهي عملية يشار إليها باسم النقل الميكانيكي ، بوساطة البروتينات التي تستجيب لتشوه الهياكل الخلوية أو المصفوفة خارج الخلية المرتبطةبها 18،19،20،21. تعتبر القنوات الأيونية المنشطة ميكانيكيا فريدة من نوعها بمعنى أنها تنتقل من حالة مغلقة إلى حالة نفاذية مفتوحة استجابة للتغيرات في توتر الغشاء أو الضغط أو إجهاد القص18،19،20،21،22. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن بدء عابرات Ca 2+ عن طريق النقل الميكانيكي بوساطة الانتغرين أو عن طريق تنشيط أنظمة الالتصاق المستجيبة ميكانيكيا عند تقاطعات الخلاياالخلوية 23،24،25،26. عادة ما يتم تقييم وظيفة القناة الأيونية باستخدام تقنية المشبك الرقعة ، والتي تتضمن تكوين ختم جيجا أوم بين غشاء الخلية وماصة التصحيح27. ومع ذلك ، يصعب الوصول إلى الخلايا الموجودة في طبقات الأنسجة العميقة ذات المصفوفة الكثيفة خارج الخلية (مثل الأنابيب الكلوية) أو المحاطة بحاجز مادي (مثل الجليكوكاليكس) باستخدام ماصة زجاجية دقيقة. وبالمثل ، لا يمكن دراسة الخلايا المدمجة أو التي هي أجزاء متكاملة من الأنسجة ذات الاستقرار الميكانيكي الضعيف (على سبيل المثال ، الظهارة البولية) بسهولة باستخدام تقنية المشبك الرقعي. نظرا لأن العديد من القنوات الأيونية المنشطة ميكانيكيا قابلة للنفاذ إلى Ca 2+ ، فإن النهج البديل هو تقييم نشاطها بواسطة الفحص المجهري الفلوري باستخدام صبغة حساسة ل Ca2+ أو مؤشرات الكالسيوم المشفرة وراثيا (GECIs) مثل GCaMP. أدت الجهود الأخيرة في هندسة البروتين إلى زيادة كبيرة في النطاق الديناميكي والحساسية والاستجابة ل GECIs28،29،30 ، وقد سمح التقدم في علم الوراثة بالتعبير عنها في مجموعات خلايا معينة ، مما يجعلها مناسبة بشكل مثالي لدراسة النقل الميكانيكي.
تعمل الظهارة البولية ، وهي الظهارة الطبقية التي تغطي الجزء الداخلي من المثانة البولية ، كحاجز ، مما يمنع انتشار المواد المذابة البولية في الخلالي المثانة ، ولكنه يعمل أيضا كمحول ، ويستشعر امتلاء المثانة وينقل هذه الأحداث إلى الأعصاب والعضلات الكامنة16. أظهرت الدراسات السابقة أن الاتصال بين الظهارة البولية والأنسجة الكامنة يتطلب القنوات الأيونية المنشطة ميكانيكيا Piezo1 و Piezo231. لتقييم عابرات Ca 2+ المستحثة ميكانيكيا في خلايا الظهارة البولية ، تم تطوير تقنية جديدة موصوفة تستخدم نقل الجينات الفيروسية الغدية للتعبير عن مستشعر Ca2+ GCaMP5G في خلايا الظهارة البولية. تستخدم هذه التقنية إعداد ورقة مخاطية توفر وصولا سهلا إلى طبقة الخلايا المظلة الخارجية ونظام بمساعدة الكمبيوتر للتحفيز الميكانيكي المتزامن للخلايا الفردية باستخدام ماصة زجاجية مغلقة وتسجيل التغيرات في التألق بمرور الوقت.

<table><tbody><tr><td>20x الهدف</td><td>أوليمبوس</td><td>UMPlanFL N</td><td></td></tr><tr><td>24 G & frac34 ؛ &rdquo; القسطرة</td><td>Medline&nbsp;</td><td>Suresite IV الشريحة&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>4x الموضوع</td><td>أوليمبوس</td><td>UPlanFL N</td><td></td></tr><tr><td>محول تناظري / رقمي</td><td>الأجهزة الجزيئية</td><td>Digidata 1440A</td><td></td></tr><tr><td>الأجسام المضادة المضادة ل GFP</td><td>Abcam & nbsp ؛</td><td>Ab6556</td><td></td></tr><tr><td>شعاع الخائن</td><td>Chroma</td><td>T495lpxr</td><td></td></tr><tr><td>تحكم في درجة الحرارة ثنائية القطب &nbsp ؛</td><td>Warner Instruments</td><td>TC-344B</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Fluka</td><td>21114-1L</td><td>1M</td></tr><tr><td>solution cells software</td><td>Olympus</td><td></td><td>Imaging</td></tr> Camera <tr><td>CMOS</td><td>Hamamatsu</td><td>ORCA fusion</td><td></td></tr><tr><td>Donkey Anti rabbit contrugated to Alexa Fluor 488 &nbsp ؛</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>711-545-152</td><td></td></tr><tr><td>Excel</td><td>Microsoft Corporation</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Filter &nbsp;</td><td>كروما&nbsp;</td>الشعيرات الدموية <td>الزجاجية ET470 / 40X</td><td></td></tr> زجاج <tr><td>Corning 8250</td><td>Warner Instruments&nbsp;</td><td>G85150T-4</td><td></td></tr><tr><td>جلوكوز</td><td>سيجما</td><td>G8270</td><td></td></tr><tr><td>HEPES &nbsp;</td><td>Sigma</td><td>H4034</td><td></td></tr><tr><td>سخان مضمن&nbsp;</td><td>Warner Instruments</td><td>SH-27B</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>793590</td><td></td></tr><tr><td>مصدر الضوء</td><td>Sutter Instruments</td><td>Lambda XL & nbsp ؛</td><td></td></tr><tr><td>أنابيب مضخة مشعبة</td><td>Fisherbrand</td><td>14-190-510</td><td>ID 1.52 مم</td></tr><tr><td>أنابيب مضخة مشعبة</td><td>Fisherbrand</td><td>14-190-533</td><td>معرف 2.79 مم</td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma</td><td>M9272</td><td></td></tr><tr><td>الفئران & nbsp ؛</td><td>جاكسون لاب</td><td>664</td><td>2-4 أشهر أنثى C57BL / 6J</td></tr><tr><td>Microforge</td><td>Narishige &nbsp ؛</td><td>MF-830</td><td></td></tr><tr><td>Micromanipulator</td><td>Sutter Instruments</td><td>MP-285</td><td></td></tr><tr><td>مجهر</td><td>أوليمبوس</td><td>BX51W</td><td></td></tr><tr><td>وسائط التركيب مع DAPI</td><td>Invitrogen</td><td>S36964 &nbsp ؛</td><td>Slowfade Diamond Antifade مع DAPI</td></tr><tr><td>كلوريد الصوديوم &nbsp;</td>برنامج <td>Sigma</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>pClamp</td><td>الأجهزة الجزيئية</td><td>الإصدار 10.4</td><td>برنامج الحصول على بيانات الفيزيولوجيا الكهربية المشبك التصحيح وتحليل</td></tr><tr><td>المضخة التمعجية</td><td>Gilson</td><td>Minipuls 3</td><td></td></tr><tr><td>المحرك الكهروإجهادي</td><td>Thorlabs</td><td>PAS005</td><td></td></tr><tr><td>حامل الماصة</td><td>العالمية أدوات</td><td></td><td></td>الدقة</tr><tr><td>مجتذب الماصات</td><td>Narishige</td><td>PP-830</td><td></td></tr><tr><td>قاعدة ساخنة سريعة التبادل مع مجموعة حلقات التروية والمحول</td> منصة <td>التبادل السريع Warner Instruments</td><td>QE-1</td><td>تناسب طبق 35 مم &nbsp ؛ &nbsp;</td></tr><tr><td>الرودامين - فالويدين&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>R415</td><td></td></tr><tr><td>Sigma-Plot</td><td>Systat Software Inc</td><td>الإصدار 14.0</td> الرسوم <td>البيانية العلمية وبرامج تحليل البيانات&nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>مطاط سيليكون</td><td>Dow</td><td>Sylgard 184</td><td></td></tr><tr><td>وحدة تحكم بيزو أحادية القناة ذات حلقة مفتوحة</td><td>Thorlabs</td><td>MDT694B</td><td></td></tr><tr><td>وسادة حامل الشبكة المربعة</td><td>تيد بيلا</td><td>10520</td><td></td></tr><tr><td>خياطة</td><td>AD الجراحية</td><td>S-S618R13</td><td>6-0 قضيب تركيب تفلون Sylk</td></tr><tr><td></td><td>مخصص</td><td></td><td>استخدم لتركيب المشغل الكهرضغطية في المشغل الدقيق</td></tr><tr><td>أنابيب</td><td>فيشر 14171129 العلمي</td><td></td><td>Tygon S3 ID 1/16 IN, OD 1/8 IN</td></tr><tr><td>USB جهاز الإدخال / الإخراج الرقمي&nbsp;</td><td>الأجهزة الوطنية</td><td>NI USB-6501</td><td></td></tr></tbody></table>

إكس فيفو تحليل عابرات الكالسيوم2+ المنشطة ميكانيكيا في خلايا الظهارة البولية

Ex Vivo Analysis of Mechanically Activated Ca2+ Transients in Urothelial Cells

القنوات الأيونية المنشطة ميكانيكيا هي محولات طاقة بيولوجية تحول المحفزات الميكانيكية مثل قوى التمدد أو القص إلى إشارات كهربائية وكيميائية حيوية. في الثدييات ، تعد القنوات التي يتم تنشيطها ميكانيكيا ضرورية للكشف عن المحفزات الخارجية والداخلية في عمليات متنوعة مثل الإحساس باللمس والسمع وتنظيم حجم خلايا الدم الحمراء وتنظيم ضغط الدم الأساسي والإحساس بامتلاء المثانة البولية. في حين أن وظيفة القنوات الأيونية المنشطة ميكانيكيا قد تمت دراستها على نطاق واسع في الإعداد في المختبر باستخدام تقنية المشبك الرقعي ، فإن تقييم وظيفتها في بيئتها الأصلية لا يزال مهمة صعبة ، غالبا بسبب محدودية الوصول إلى مواقع التعبير عن هذه القنوات (على سبيل المثال ، المحطات الطرفية الواردة ، وخلايا ميركل ، ومستقبلات الضغط ، والأنابيب الكلوية) أو صعوبات تطبيق تقنية المشبك الرقعي (على سبيل المثال ، الأسطح القمية لخلايا مظلة الظهارة البولية). يصف هذا البروتوكول إجراء لتقييم عابري Ca 2+ المستحثين ميكانيكيا باستخدام مستشعر الفلورسنت GCaMP5G في إعداد ظهارة البول خارج الجسم الحي ، وهي تقنية يمكن تكييفها بسهولة لدراسة أحداث Ca2+ المستحثة ميكانيكيا في مستحضرات الأنسجة الأصلية الأخرى.

يصف البروتوكول الحالي تقنية لتقييم عابرات Ca 2+ المستحثة ميكانيكيا في الخلايا المظلة باستخدام مستشعر Ca2+ الفلوري GCaMP5G. تم استخدام نقل الفيروس الغدي للتعبير عن GCaMP5G في خلايا الظهارة البولية بسبب كفاءته العالية ولأنه ينتج مستوى مرتفعا من التعبير. يوضح الشكل 2 د صورا فلورية للمقاطع البردية الملطخة من المثانة المستحثة. بالنسبة لهذه التجارب ، يكون تعبير GCaMP5G أعلى في طبقة الخلية المظلية. يوضح الشكل 3 أ سلسلة من الصور التمثيلية التي تم ا...

يصف هذا البروتوكول منهجية لتقييم وظيفة القنوات الأيونية المنشطة ميكانيكيا في خلايا الظهارة البولية الأصلية باستخدام مستشعر Ca2+ الفلوري GCaMP5G.

Mechanically activated ion channels are biological transducers that convert mechanical stimuli such as stretch or shear forces into electrical and ...

يصف هذا البروتوكول تقنية لدراسة حدث الكالسيوم المستحث ميكانيكيا في تحضير الظهارة البولية خارج الجسم الحي. هذه التقنية سهلة التنفيذ نسبيا ويمكن تكييفها لدراسة حدث الكالسيوم المستحث ميكانيكيا في مستحضرات الأنسجة الأصلية الأخرى. قم بتصنيع الماصات الدقيقة عن طريق وضع الزجاج الشعري في الساحب وتعديله باستخدام مقابض الاحتفاظ بالشعيرات الدموية.اسحب الشعيرات الدموية الزجاجية على خطوتين وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. أغلق طرف الماصات الدقيقة باستخدام microforge مع ضبط مقبض ضبط السخان على 60. بعد تعريض المثانة وعظم الحوض للفأر الرحيم ، قم بكسر عظم الحوض لكشف مجرى البول وقنية مجرى البول باستخدام قسطرة قياس 24.استخدم خياطة 6-0 لتثبيت القسطرة في مجرى البول. احصد المثانة والإحليل وألصقهما على وسادة حامل من مطاط السيليكون مغمورة في محلول التسجيل. افصل الغشاء المخاطي للمثانة عن الطبقة العضلية الأساسية بالملقط الناعم.اقطع الغشاء المخاطي للمثانة وقم بتثبيته بحيث تكون الظهارة البولية متجهة لأعلى مع إدخال مطاط صناعي من السيليكون في قاع طبق زراعة الأنسجة بقطر 35 ملم. قم بتركيب طبق زراعة الأنسجة باستخدام الغشاء المخاطي للمثانة المثبت في مرحلة المجهر المجهزة بحاضنة أطباق الثقافة مع عناصر تسخين مقاومة. قم بتغذية طبق زراعة الخلايا بشكل مستمر بمعدل 1.7 ملليلتر في الدقيقة بمحلول تسجيل يتم تسخينه عند 37 درجة مئوية باستخدام سخان مضمن.حافظ على درجة حرارة حاضنة أطباق الأنسجة والمحاليل عند حوالي 37 درجة مئوية باستخدام جهاز تحكم في درجة الحرارة ثنائي القطب ثنائي القناة. لتسجيل عابرات أيونات الكالسيوم المستحثة ميكانيكيا ، اغمر الماصة الدقيقة في محلول التسجيل. تحت إضاءة المجال الساطع ، باستخدام هدف مسح منخفض التكبير ، انقل الماصة الدقيقة إلى مركز الحقل.حرك المعالج الدقيق في المستوى الرأسي واضبط التركيز لتحريك الماصة بالقرب من سطح نسيج الظهارة البولية. قم بالتبديل إلى الهدف بتكبير أعلى وفتحة عددية مناسبة للتألق المناعي. اضبط المعالج الدقيق على غرامة وتحريك الماصة بالقرب من الجزء العلوي من الخلية المستهدفة.إذا لزم الأمر ، اضبط التركيز وموضع الماصة. افتح بروتوكول التحفيز في برنامج الفيزيولوجيا الكهربية واضبطه على التشغيل. اضبط التركيز واضغط على البدء في مدير التجربة لبدء الحصول على البيانات.يؤدي هذا إلى تشغيل المشغل الكهرضغطية وإنشاء ملف بصور التجربة. عندما يتم تحفيز الخلية ، لوحظ زيادة في مضان. لتحديد شدة الفلورسنت ، افتح ملف الصورة في برنامج التصوير وحدد نافذة العد والقياس.قم بتشغيل الفيلم لتحديد الخلية المحفزة. حدد أداة المضلع وارسم عائد استثمار على حدود الخلية التي تم طعنها. انتقل إلى نافذة القياس ، وحدد ملف تعريف الكثافة ، واضبط القياس على العمل الإضافي ، والنتائج على المتوسط ، وطرح الخلفية على لا شيء ، ثم اضغط على تنفيذ.سيتم حساب متوسط شدة التألق بمرور الوقت. لتصدير بيانات ملف تعريف الكثافة ، انقر فوق رمز Excel في نافذة نتائج ملف تعريف الكثافة وقم بإجراء تحليل البيانات باستخدام الرسوم البيانية العلمية وبرامج تحليل البيانات. في هذه الدراسة ، تم وخز الخلية المظلة لتقييم عابري الكالسيوم المستثارين ميكانيكيا.تظهر الصورة التي تم التقاطها في 10 ثوان منظرا فلوريا للماصة المحفزة الموضوعة أعلى خلية مظلة تعبر عن مستشعر الكالسيوم الفلوري GCaMP5G. يؤدي التحفيز الميكانيكي للخلية المظلة التي تعبر عن مستشعر الكالسيوم إلى تشوه تليه زيادة سريعة في انبعاث التألق. يوضح التمثيل البياني تغيرا في شدة التألق المرسومة كدالة للزمن لعدة خلايا.يثير الوخز استجابة الكالسيوم في معظم الخلايا المظلة التي يتم تحويلها باستخدام مستشعر الكالسيوم الفلوري. الخطوة الأكثر أهمية هي حصاد المثانة والإحليل ، تليها لصقها على وسادة حامل مطاط السيليكون. تجنب تلف الأنسجة عند فصل الغشاء المخاطي للمثانة عن الطبقة العضلية الأساسية.يمكن أن توفر طرق التصوير مثل تلك الموصوفة هنا نظرة ثاقبة فريدة حول كيفية إرسال القنوات التي يتم تنشيطها ميكانيكيا للتغييرات في بيئتها الأصلية وتوليد استجابات فسيولوجية.

ex-vivo-analysis-mechanically-activated-ca2-transients-urothelial

Research

JoVE Journal

Medicine

الطب

تفاصيل أساليب عالية الدقة...

تنسيق كا 2 + الكشف العابر في العضلات الملساء

يوضح هذا الفيديو توصيف التيارات الموجبة من القنوات الأيونية المحتملة للمستقبلات العابرة من النوع 4 (TRPM4) في خلايا العضلات الملساء المكسومة باستخدام تقنية مشبك التصحيح المثقوب بوساطة الأمفوتريسين-B. تساعد هذه التقنية في تقييم الخصائص الفيزيائية الحيوية والدوائية للقنوات الأيونية.

تحليل المشبك المثقوب بوساطة الأمفوتريسين-B: تقنية الفيزيولوجيا الكهربية لدراسة التيارات الأيونية في خلايا المثانة البولية

تحفيز الميكانيكية التي يسببها الكالسيوم انتشار الموجات في الخلية monolayers: مثال من الأبقار الخلايا البطانية القرنية

وراثيا المرمزة Ca2 + المؤشرات (جيسيس) قد تغيرت تغيرا جذريا في الموقع كيف Ca2 + تصوير تتم. إلى أقصى حد ممكن لاستعادة البيانات من هذه التسجيلات، مطلوب تحليل Ca2 + إشارات مناسبة. البروتوكولات في هذه الورقة تيسير التحديد الكمي ل Ca2 + إشارات سجلت في الموقع باستخدام رسم الخرائط الزمانية المكانية والتحليل القائم على الجسيمات.

تطبيقات رسم الخرائط الزمانية وتقنيات تحليل الجسيمات للتحديد الكمي لداخل الخلية Ca2 + إشارات في الموقع

نحن نصف طريقة لإعداد واحد معزولة حديثا خلايا العضلات الملساء معزولة من عينات المثانة البولية البشرية التي تستخدم إجراء الأنزيمية خطوتين. يمكن دراسة خلايا DSM القابلة للحياة التي تم الحصول عليها من خلال تقنيات خلية واحدة مختلفة بما في ذلك الفيزيولوجيا الكهربية المثبتة في البوهوتريسين-B الموصوفة للكشف عن الخصائص الفسيولوجية والدوائية.

إعداد واستخدام خلايا العضلات الملساء الإنسان معزولة حديثا لتوصيف 9-فينانترول الحساسة التيارات التيشن

ويتيح نموذج المثانة الخالي من الدعامات امكانيه الوصول المباشر إلى السوبوروثثيلال لدراسة أليات المحلية لتنظيم توافر الوسيط النشط بيولوجيا في بروبيوروثيلال/لأمينا بروبروا اثناء تخزين وتفريغ البول. التحضير يشبه بشكل وثيق ملء المثانة السليمة ويسمح باجراء دراسات حجم الضغط دون التاثيرات الجهازية.

A لامركزية (فيفو السابقين) نموذج المثانة Murine مع أزاله العضلات ديتروور للوصول المباشر إلى السوبوروثثيلال اثناء ملء المثانة

تم إثبات نموذج الفأر للتلقيح عبر الإشريكية القولونية المسببة للأمراض البولية (UPEC) لإنشاء خزانات المثانة الكامنة داخل الخلايا والتعرض اللاحق للمثانة ل G. vaginalis للحث على UPEC UTI المتكرر. كما ثبت تعداد البكتيريا ، وعلم خلايا البول ، وتثبيت المثانة في الموقع ومعالجتها للمجهر الإلكتروني الماسح.

عدوى الإشريكية القولونية المتكررة في المسالك البولية الناجمة عن التعرض للمثانة المهبلية Gardnerella في الفئران

يصف هذا البروتوكول الإجراء الخاص بقياس تركيزات ATP في تجويف المثانة في القوارض المخدرة.

في الجسم الحي القياس اللمعي لإطلاق ATP اليوروتيني المستحث بالانتفاخ في القوارض

يتم وصف طرق لتوليد كميات كبيرة من الفيروسات الغدية المؤتلفة ، والتي يمكن استخدامها بعد ذلك لتحويل ظهارة القوارض الأصلية مما يسمح بالتعبير عن الجينات المحورة أو خفض تنظيم منتجات الجينات الداخلية.

التعبير عن الجينات المحورة في ظهارة المسالك البولية في المثانة الأصلية باستخدام النقل بوساطة الفيروس الغدي

يقدم هذا البروتوكول طريقة محسنة لعزل بطانة الظهارة في إحليل الإناث البالغة من أجل التحليلات اللاحقة، بما في ذلك قياس تدفق الخلية، وصبغ المناعة، وزراعة العضويات. أسفرت الطرق عن خلايا ظهارية إحليل غنية وقابلة للحياة، كما يتضح من تحليل قياس التدفق الخلوي، والتصوير الكامل، وتكوين الأعضاء الفعال.

طريقة محسنة لعزل الظهارة الإحليل في إناث الفأر لتحليل الخلايا الأحادية والتحليل المناعي الفلوري

اكتشف تقنية تحليل عابرات الكالسيوم المنشطة ميكانيكياً في خلايا الظهارة البولية خارج الجسم باستخدام مستشعر GCaMP5G. تساعد هذه الطريقة الباحثين على دراسة قنوات الأيونات المنشطة ميكانيكياً.

إكس فيفو تحليل عابرات الكالسيوم²⁺ المنشطة ميكانيكيا في خلايا الظهارة البولية

استكشف المزيد من الفيديوهات