التعبير عن الجينات المحورة في ظهارة المسالك البولية في المثانة الأصلية باستخدام النقل بوساطة الفيروس الغدي
أكتوبر 6, 2022
يتم وصف طرق لتوليد كميات كبيرة من الفيروسات الغدية المؤتلفة ، والتي يمكن استخدامها بعد ذلك لتحويل ظهارة القوارض الأصلية مما يسمح بالتعبير عن الجينات المحورة أو خفض تنظيم منتجات الجينات الداخلية.
يصف هذا البروتوكول الطرق التي تسمح للمحققين بالتعبير عن CDNAs أو SIRNAs في ظهارة المسالك البولية في المثانة الأصلية. المزايا الرئيسية لهذه التقنية هي بساطتها النسبية ، والقدرة على التعبير عن cDNAs ، siRNAs في الظهارة البولية بكفاءة عالية ، وخلال فترة زمنية قصيرة نسبيا. الجزء الأصعب من هذه التقنية هو القسطرة.
ومع ذلك ، فإن التقنية الشاملة سهلة نسبيا لإتقانها بمجرد تعلمها. سيكون جيوفاني رويز ، أخصائي الأبحاث الرابع في مختبري. للبدء ضع الماوس المخدر على وسادة تدفئة بجوار مخاريط الأنف.
الحفاظ على الحيوان تحت التخدير طوال مدة البروتوكول. تأكد من تخدير الماوس تماما بقرصة إصبع القدم. لمنع دخول الهواء إلى المثانة ، املأ جزء القسطرة البلاستيكية من القسطرة الوريدية والمحور المرتبط بها ب PBS المعقم باستخدام ماصة نقل أو حقنة معقمة.
مع الحيوان في موقف ضعيف مسحة الصماخ مجرى البول الخارجي مع 70 ٪ الكحول. ثم أمسك برفق الأنسجة التي تشكل صماخ مجرى البول الخارجي وقم بتمديده عموديا بعيدا عن الحيوان باستخدام ملقط دقيق. أدخل القسطرة المعقمة في الصماخ الخارجي.
باستخدام اليد الأخرى ، أدخل القسطرة عموديا بعناية حوالي ثلاثة إلى أربعة ملليمترات في صماخ مجرى البول. ثم قم بخفض القسطرة التي يتم إدخالها في الصماخ الخارجي باتجاه ذيل الحيوان ، مما يسهل دخوله إلى جزء مجرى البول الذي يمر أسفل عظم العانة وفي النهاية إلى المثانة. اسمح للبول في المثانة بالتسرب.
قم بإزالة أي بول متبقي عن طريق إجراء مناورة Crede عن طريق التدليك والضغط برفق على نتوء المثانة في منطقة أسفل البطن. لجعل الظهارة البولية متقبلة للتنبيغ ، اغسل الفأر أو مثانة الفئران عن طريق ربط حقنة معقمة واحدة ملليلتر مملوءة ب PBS بمحور القسطرة. حقن 100 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني معقم في المثانة الماوس.
بعد فصل المحقنة عن تركيب القسطرة ، اترك برنامج تلفزيوني بالتصريف. غرس 100 ميكرولتر من 0.1٪ N-dodecyl-beta-D-maltoside المذاب في PBS ومرشح 0.2 ميكرومتر معقم في مثانة الماوس باستخدام حقنة معقمة سعة ملليلتر واحد. احتفظ ب N-dodecyl-beta-D-maltoside في المثانة لمدة 10 دقائق عن طريق ترك المحقنة في مكانها.
قم بإزالة N-dodecyl-beta-D-maltoside من المثانة عن طريق فصل المحقنة والسماح لها بالتصريف. لإدخال الفيروس في المثانة ، قم بتوصيل حقنة معقمة بحجم ملليلتر واحد إلى مركز القسطرة وغرس 5،000،000 إلى 100،000،000 IVP من الفيروس الغدي المخفف في 100 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني معقم للفئران ، أو 450 ميكرولتر للفئران في المثانة. بعد 30 دقيقة ، افصل المحقنة واسمح لمحلول الفيروس بإخلاء المثانة على وسادة يمكن التخلص منها.
امسح أي محلول فيروسي متبقي بمنديل ماص أثناء التخلص من الضمادة وامسح النفايات الخطرة بيولوجيا. من أجل السماح للحيوان بالتعافي ، توقف عن تدفق الأيزوفلوران. اسمح للحيوان بالتعافي والحركة الكاملة قبل إعادته إلى قفصه ، خاصة إذا كانت الحيوانات مجمعة.
تحليل آثار التعبير الجيني المحور بعد 12 إلى 72 ساعة من العلاج باستخدام طرق مثل تهجين mRNA في الموقع أو اللطخة الغربية أو التألق المناعي. كشف تحليل اللطخة الغربية لمحللات الظهارة البولية عن تعبير هرمون النمو البشري الموسوم ب V5 في ظهارة البول للمثانات المتحولة ، ولكن ليس في تلك غير المحولة. تم تأكيد التعبير أيضا من خلال التألق المناعي باستخدام الأجسام المضادة التي تعرفت على هرمون النمو البشري ، أو علامة V5 epitope.
أكد تحليل اللطخة الغربية تعبير Claudin-2 في الفئران التي تم تحويلها بالفيروس الغدي ، ولكن ليس في تلك التي تم تحويلها باستخدام فيروس ترميز GFP خاضع للرقابة. أكد تحليل التألق المناعي كذلك تعبير Claudin-2 الخارجي في خلايا مظلة الظهارة البولية المنقولة بتشفير الفيروس Claudin-2 cDNA. كشف الكشف عن Claudin-2 الخارجي في بروتين التقاطع الضيق 1 عن طريق التألق المناعي والفحص المجهري متحد البؤر للظهارة البولية المركبة أو المستعرضة بالكامل عن وجود تقاطع ضيق وتراكمات داخل الخلايا من Claudin-2 في سيتوبلازم الخلية.
يظهر حقل الصورة أن حساب عدد الخلايا المظلة المستحثة يكشف عن كفاءة تقترب من 95٪وفي كامل جدار المثانة يتم تحويل الظهارة البولية فقط ، ولا يتم استهداف أي نسيج آخر بواسطة الفيروس الغدي المغروس. القسطرة أمر بالغ الأهمية لكي يعمل البروتوكول على النحو المنشود. تسمح هذه التقنية للباحثين بدراسة بيولوجيا الظهارة البولية الطبيعية ، وكذلك فهم الحالات التي يؤدي فيها الإفراط في التعبير عن البروتين ، أو نقص التعبير ، إلى المرض.
اعرض النص الكامل واحصل على الوصول إلى آلاف الفيديوهات العلمية
النظرة العامة
تقدم هذه الدراسة بروتوكولاً لنقل فعال للأورام الغدية المخاطية للقوارض باستخدام الفيروسات الغدية المؤتلفة، مما يتيح التعبير عن الحمض النووي المكرر والحمض النووي الريبي المتدخل الصغير. تشمل النتائج الرئيسية تحقيق كفاءة نقل تقارب 95% في الخلايا الظهارية المثانية، مما يسهل البحث في بيولوجيا الظهارة المثانية والأمراض ذات الصلة.
مكونات الدراسة الرئيسية
منطقة البحث
- بيولوجيا الظهارة المثانية
- تنظيم التعبير الجيني
- تقنيات النقل
الخلفية
- أهمية الظهارة المثانية في وظيفة المثانة
- التحديات في دراسة التعبير الجيني في الجسم الحي
- الحاجة إلى طرق نقل فعالة
الطرق المستخدمة
- استخدام الفيروس الغدي المؤتلف لتوصيل الجينات
- نماذج الفئران والجرذان
- اختبارات الـ Western blot وتحليل التألق المناعي للتقييم
النتائج الرئيسية
- تم إثبات الكفاءة العالية للتعبير عن الجينات المنقولة في الخلايا الظهارية المثانية
- تم تأكيد التعبير عن بروتينات معينة، مثل Claudin-2 وهرمون النمو البشري
- ثبت أن الفيروس الغدي ينقل الظهارة المثانية بشكل خاص دون التأثير على الأنسجة المجاورة
الاستنتاجات
- يسمح هذا البروتوكول بدراسات متعمقة لوظيفة الجينات في الظهارة المثانية
- يوفر رؤى حول الحالات التي تؤثر على بيولوجيا المثانة، مما يساهم في البحث البيولوجي الأوسع
الأسئلة الشائعة
Executive Industry Relevance
Adenovirus-mediated transgene delivery in native bladder urothelium enables rapid, high-efficiency modulation of gene expression in vivo, addressing a critical bottleneck in functional target validation for lower urinary tract research. This approach supports mechanistic de-risking and predictive confidence at the discovery and preclinical interface, facilitating portfolio decisions for programs targeting urothelial biology. The method's specificity and scalability position it as a reusable platform for interrogating gene function and disease mechanisms in rodent models.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct interrogation of gene function in native urothelial tissue for mechanistic de-risking.
- Supports functional validation of candidate targets through controlled overexpression or knockdown.
- Facilitates rapid hypothesis testing in disease-relevant rodent models.
Screening & Assay Development
- Prepares validated in vivo systems for downstream phenotypic or biomarker assays.
- Delivers reproducible, high-efficiency transduction for quantitative protein expression analysis.
- Enables robust comparison of transgene effects using standardized readouts such as Western blot and immunofluorescence.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant models for translational biomarker exploration in bladder research.
- Provides continuity from discovery-stage gene modulation to preclinical functional assessment.
- Supports risk-adjusted advancement of urothelial targets based on in vivo functional data.
Pipeline & Workflow Integration
This adenoviral transduction protocol integrates at the interface of early discovery and preclinical validation, enabling rapid target interrogation and functional assessment in rodent models.
- Discovery Biology: Supports hypothesis-driven testing of gene function and pathway involvement in urothelial tissue.
- Screening: Provides a reproducible platform for quantitative assessment of transgene expression and downstream effects.
- Analytics: Enables robust measurement of protein expression via Western blot and immunofluorescence for comparative analysis.
- Translational Research: Bridges discovery and preclinical stages by enabling disease-relevant gene modulation in vivo.
- Enterprise Reuse: Offers a scalable, adaptable protocol for repeated use across multiple gene targets and rodent models.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in urothelial target validation.
- Operational Value: Delivers standardized, high-efficiency gene delivery with reproducible outcomes.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision-making and capital allocation by providing rapid in vivo functional data.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of urothelial targets for advancement or deprioritization.
Implementation Considerations
- Requires technical expertise in rodent catheterization and in vivo gene delivery.
- Needs access to high-titer adenoviral vectors and analytical tools for protein detection.
- Demands rigorous cross-team standardization for reproducibility and data comparability.
- Adaptation to other tissues or species may require protocol optimization.
- Catheterization is a critical step and may present a learning curve for new operators.
