اضطراب الحاجز الدموي للحبل الشوكي باستخدام الموجات فوق الصوتية المركزة منخفضة الكثافة في نموذج الفئران

الحاجز الدموي النخاعي مرتبط بإحكام وله نفاذية محدودة. يسمح هذا البروتوكول للباحثين بفتح حاجز الحبل الشوكي الدموي بأمان وعابر ، باستخدام الفقاعات الدقيقة والموجات فوق الصوتية المركزة. تسمح هذه التقنية بفتح حاجز الحبل الشوكي الدموي إلى جزء الحبل الشوكي المستهدف.

بالإضافة إلى ذلك ، يمكن تأكيد الاضطراب بسهولة عن طريق المراقبة البصرية أو الفحص المجهري الفلوري. يمكن استكشاف هذا البروتوكول لإمكاناته في تحسين توصيل العلاجات الجينية أو الأدوية إلى الحبل الشوكي لعلاج الأورام أو الضمور أو الإصابة. إظهار الإجراء سيكون ميغانا بهيمريدي.

طالب دكتوراه ممتاز من مختبري ، والذي يقوم يوميا بسد الفجوة بين الهندسة والطب. للبدء ، احصل على نظام محول طاقة بالموجات فوق الصوتية مركز بمواصفات كافية لتحقيق حاجز الحبل الشوكي الدموي ، أو فتحات BSCB في الفئران. قم بتثبيت حامل المسبار المطبوع 3D ومخروط الماء على محول الطاقة.

تأكد من وجود مانع تسرب مانع لتسرب الماء بين المخروط ومحول الطاقة. ثبت غشاء البوليستر المعقم ، بسمك 50 ميكرون ، الشفاف صوتيا ، في قاع مخروط الماء باستخدام شريط مطاطي. املأ مخروط الماء بالماء منزوع الغازات ومنزوع الأيونات باستخدام أنابيب المدخل والمخرج.

تجنب فقاعات الهواء داخل المخروط ، لأنها يمكن أن تعطل الاقتران الصوتي بين محول الطاقة والهدف. في هذه المرحلة ، يجب تضخيم غشاء مايلر قليلا. قم بتوصيل معدات القيادة التي تحتوي على مولد الموجة ومضخم محرك التردد اللاسلكي بمحول الطاقة.

ثبت ذراع التوضيع التجسيمي بلوحة التثبيت وقم بتوصيل حامل المسبار بالذراع. سجل وزن أنثى فأر Sprague-Dawley المخدر ، وقم بإجراء اختبار قرصة إصبع القدم والذيل ، لتأكيد التخدير. ضع وسادة تدفئة ووسادة ماصة معقمة على لوحة التثبيت.

ضع الفئران على وسادة ماصة. ضع مرهم العين وضع مقياس حرارة المستقيم لمراقبة درجة حرارة الجسم. جس الضلع الأخير من الفئران ، والذي يرتبط بالعمود الفقري في الفقرات الصدرية 13.

استخدم ماكينة حلاقة كهربائية لحلق الفراء من السطح الظهري بين الضلع الأخير والرقبة. امسح الجلد المكشوف بشاش مغموس في 10٪ يودوبوفيدون. قم بإنشاء شق في خط الوسط باستخدام مقص القزحية وقم بتشريحه من خلال اللفافة حتى تنكشف العمليات الشائكة والصفيحة.

قم بإزالة العظم باستخدام كماشة عظمية الإزاحة ومقص قزحية الشفرة بزاوية ، حتى ينكشف الحبل الشوكي. تأمين الفئران إلى لوحة التثبيت عن طريق تثبيت العمليات الشائكة المجاورة لاستئصال الصفيحة الفقرية. ثم اسحب المشابك قليلا لجعل العمود الفقري مشدودا.

اضبط موضع الترجام باستخدام ذراع التوضيع التجسيمي حتى يقع فوق استئصال الصفيحة الفقرية بالضبط. ثبت جهاز الليزر في قاع مخروط الماء وقم بخفضه حتى تظهر نقطة الليزر. ثم اضبط الموضع الجانبي لمحول الطاقة حتى تصبح نقطة الليزر فوق الموقع المستهدف لتعطيل BSCB.

قم بإزالة جهاز الليزر واملأ الفراغ بين المخروط والحبل الشوكي بهلام الموجات فوق الصوتية المنزوع الغازات ، دون إدخال فقاعات هواء. تعيين المعلمات لصوتنة على خرج الطاقة محول. قم بإعداد محلول microbubble وفقا لتعليمات الشركة الصانعة.

لزيادة فرص نجاح قسطرة الوريد الذيل ، اغمس الذيل في ماء دافئ وضع عاصبة في قاعدة الذيل لتكبير قطر الأوردة. ثم أدخل قسطرة وريد الذيل قياس 22 واغسلها ب 0.2 ملليلتر من محلول ملحي هيبارين. حقن ملليلتر واحد لكل كيلوغرام من 3٪ Evans Blue Dye ، أو EBD في القسطرة.

ثم اغسل القسطرة ب 0.2 ملليلتر من محلول ملحي هيبارين. تأكد من نجاح قسطرة الوريد الذيل عن طريق التحقق من تغير اللون الأزرق في الجلد أو العينين أو الوريد الفقري الظهري للفئران. حقن 0.2 ملليلتر بلعة من microbubbles في القسطرة وتدفق مع محلول ملحي الهيبارين قبل بدء صوتنة.

بعد القتل الرحيم للفأر ، قم بإزالة الحبل الشوكي ووضعه في 4٪ بارافورمالدهيد عند أربع درجات مئوية طوال الليل. في اليوم التالي استبدل بارافورمالدهيد ب PBS. لتصور اضطراب BSCB ، اعزل قسما يبلغ طوله سنتيمترين يحيط بموقع الصوتنة ، باستخدام شفرة حلاقة.

قسم القسم إلى أقسام بسمك 10 ميكرون باستخدام ميكروتوم وصمة عار مع صبغة الهيماتوكسيلين يوزين. بالنسبة للفحص المجهري الفلوري ، قم بإزالة الشريحة التي تحتوي على قسم الحبل الشوكي ، وقم بعكس 25 ميكرولترا من DAPI المذاب في وسط التركيب. احتضان الأقسام عند أربع درجات مئوية لمدة 10 دقائق في الظلام لمنع التبييض.

بعد الحضانة ، استخدم مجهر الفلورسنت لتصوير جميع الشرائح. تخيل الشريحة الملطخة بالهيماتوكسيلين والإيوزين باستخدام مجهر ضوئي. يمكن رؤية الأوعية الدموية للحبل الشوكي بعد استئصال الصفيحة الفقرية ، وتظهر الوريد الشوكي الخلفي ، مع وجود أوعية أصغر متعددة تشع بشكل جانبي.

بعد الحقن الوريدي ل EBD ، ظهرت الأنسجة المحيطة والأوعية الدموية للحبل الشوكي باللون الأزرق. بعد صوتنة ، تصبح بقعة زرقاء مرئية فوق الموقع المستهدف ، مما يشير إلى تسرب EBD إلى الحمة البيضاء ، بسبب اضطراب BSCB. أكد استئصال الحبل الشوكي من الفئران باستخدام الموجات فوق الصوتية المركزة منخفضة الكثافة ، أو صوتنة LIFU ، تسرب واضح من EBD في الحبل الشوكي.

في حين أن الفئران ذات السيطرة السلبية دون علاج LIFU لم تظهر تسرب EBD. أظهرت الحبال الشوكية مع صوتنة LIFU كثافة أكبر بكثير من التألق الذاتي EBD ، من الحبال التي لم تتلق صوتنة. مع كثافة مماثلة من DAPI موجودة في كليهما.

كشف تحليل الهيماتوكسيلين ويوزين عن عدم وجود تلف عصبي أو نزيف أو آفات تجويف في المواقع الصوتية. يتم عرض أمثلة على الحبال المصابة بسبب سوء التعامل الجراحي ، وصوتنة عالية الطاقة كمقارنة. في الفئران التي تلقت الفقاعات الدقيقة وعلاج LIFU ، لم يلاحظ أي تغيير في درجات المحرك ، وما قبل صوتنة ، وما بعد صوتنة ، وخلال فترة البقاء على قيد الحياة لمدة خمسة أيام.

لوحظت تغييرات طفيفة في درجة حرارة الحبل الشوكي قبل وأثناء وبعد تحليل صوتنة. من المهم الحد من الأضرار الجراحية للحبل أثناء استئصال الصفيحة الفقرية. تصور المقاطع الملطخة H و E بالمجهر ، سيشير إلى ما إذا كان قد حدث أي ضرر.

بعد اضطراب حاجز الحبل الشوكي الدموي ، باستخدام الموجات فوق الصوتية المركزة ، يمكن حقن الحيوانات بعوامل مضادة للأورام ، أو علاجات جينية. ستحدد النتيجة ما إذا كانت هذه التقنية يمكن أن تحسن تقديم العلاجات ، وتطيل البقاء على قيد الحياة في وضع أمراض الحبل الشوكي.