اضطراب الحاجز الدموي للحبل الشوكي باستخدام الموجات فوق الصوتية المركزة منخفضة الكثافة في نموذج الفئران
March 10th, 2023
يمكن تحقيق اضطراب حاجز الحبل الشوكي الدموي (BSCB) بنجاح من خلال إعطاء الفقاعات الدقيقة عن طريق الوريد وتطبيق الموجات فوق الصوتية المركزة منخفضة الكثافة (LIFU). يوضح هذا البروتوكول تفاصيل فتح BSCB باستخدام LIFU في نموذج القوارض ، بما في ذلك إعداد المعدات ، وحقن الفقاعات الدقيقة ، وتوطين الهدف ، وتصور اضطراب BSCB.
الحاجز الدموي النخاعي مرتبط بإحكام وله نفاذية محدودة. يسمح هذا البروتوكول للباحثين بفتح حاجز الحبل الشوكي الدموي بأمان وعابر ، باستخدام الفقاعات الدقيقة والموجات فوق الصوتية المركزة. تسمح هذه التقنية بفتح حاجز الحبل الشوكي الدموي إلى جزء الحبل الشوكي المستهدف.
بالإضافة إلى ذلك ، يمكن تأكيد الاضطراب بسهولة عن طريق المراقبة البصرية أو الفحص المجهري الفلوري. يمكن استكشاف هذا البروتوكول لإمكاناته في تحسين توصيل العلاجات الجينية أو الأدوية إلى الحبل الشوكي لعلاج الأورام أو الضمور أو الإصابة. إظهار الإجراء سيكون ميغانا بهيمريدي.
طالب دكتوراه ممتاز من مختبري ، والذي يقوم يوميا بسد الفجوة بين الهندسة والطب. للبدء ، احصل على نظام محول طاقة بالموجات فوق الصوتية مركز بمواصفات كافية لتحقيق حاجز الحبل الشوكي الدموي ، أو فتحات BSCB في الفئران. قم بتثبيت حامل المسبار المطبوع 3D ومخروط الماء على محول الطاقة.
تأكد من وجود مانع تسرب مانع لتسرب الماء بين المخروط ومحول الطاقة. ثبت غشاء البوليستر المعقم ، بسمك 50 ميكرون ، الشفاف صوتيا ، في قاع مخروط الماء باستخدام شريط مطاطي. املأ مخروط الماء بالماء منزوع الغازات ومنزوع الأيونات باستخدام أنابيب المدخل والمخرج.
تجنب فقاعات الهواء داخل المخروط ، لأنها يمكن أن تعطل الاقتران الصوتي بين محول الطاقة والهدف. في هذه المرحلة ، يجب تضخيم غشاء مايلر قليلا. قم بتوصيل معدات القيادة التي تحتوي على مولد الموجة ومضخم محرك التردد اللاسلكي بمحول الطاقة.
ثبت ذراع التوضيع التجسيمي بلوحة التثبيت وقم بتوصيل حامل المسبار بالذراع. سجل وزن أنثى فأر Sprague-Dawley المخدر ، وقم بإجراء اختبار قرصة إصبع القدم والذيل ، لتأكيد التخدير. ضع وسادة تدفئة ووسادة ماصة معقمة على لوحة التثبيت.
ضع الفئران على وسادة ماصة. ضع مرهم العين وضع مقياس حرارة المستقيم لمراقبة درجة حرارة الجسم. جس الضلع الأخير من الفئران ، والذي يرتبط بالعمود الفقري في الفقرات الصدرية 13.
استخدم ماكينة حلاقة كهربائية لحلق الفراء من السطح الظهري بين الضلع الأخير والرقبة. امسح الجلد المكشوف بشاش مغموس في 10٪ يودوبوفيدون. قم بإنشاء شق في خط الوسط باستخدام مقص القزحية وقم بتشريحه من خلال اللفافة حتى تنكشف العمليات الشائكة والصفيحة.
قم بإزالة العظم باستخدام كماشة عظمية الإزاحة ومقص قزحية الشفرة بزاوية ، حتى ينكشف الحبل الشوكي. تأمين الفئران إلى لوحة التثبيت عن طريق تثبيت العمليات الشائكة المجاورة لاستئصال الصفيحة الفقرية. ثم اسحب المشابك قليلا لجعل العمود الفقري مشدودا.
اضبط موضع الترجام باستخدام ذراع التوضيع التجسيمي حتى يقع فوق استئصال الصفيحة الفقرية بالضبط. ثبت جهاز الليزر في قاع مخروط الماء وقم بخفضه حتى تظهر نقطة الليزر. ثم اضبط الموضع الجانبي لمحول الطاقة حتى تصبح نقطة الليزر فوق الموقع المستهدف لتعطيل BSCB.
قم بإزالة جهاز الليزر واملأ الفراغ بين المخروط والحبل الشوكي بهلام الموجات فوق الصوتية المنزوع الغازات ، دون إدخال فقاعات هواء. تعيين المعلمات لصوتنة على خرج الطاقة محول. قم بإعداد محلول microbubble وفقا لتعليمات الشركة الصانعة.
لزيادة فرص نجاح قسطرة الوريد الذيل ، اغمس الذيل في ماء دافئ وضع عاصبة في قاعدة الذيل لتكبير قطر الأوردة. ثم أدخل قسطرة وريد الذيل قياس 22 واغسلها ب 0.2 ملليلتر من محلول ملحي هيبارين. حقن ملليلتر واحد لكل كيلوغرام من 3٪ Evans Blue Dye ، أو EBD في القسطرة.
ثم اغسل القسطرة ب 0.2 ملليلتر من محلول ملحي هيبارين. تأكد من نجاح قسطرة الوريد الذيل عن طريق التحقق من تغير اللون الأزرق في الجلد أو العينين أو الوريد الفقري الظهري للفئران. حقن 0.2 ملليلتر بلعة من microbubbles في القسطرة وتدفق مع محلول ملحي الهيبارين قبل بدء صوتنة.
بعد القتل الرحيم للفأر ، قم بإزالة الحبل الشوكي ووضعه في 4٪ بارافورمالدهيد عند أربع درجات مئوية طوال الليل. في اليوم التالي استبدل بارافورمالدهيد ب PBS. لتصور اضطراب BSCB ، اعزل قسما يبلغ طوله سنتيمترين يحيط بموقع الصوتنة ، باستخدام شفرة حلاقة.
قسم القسم إلى أقسام بسمك 10 ميكرون باستخدام ميكروتوم وصمة عار مع صبغة الهيماتوكسيلين يوزين. بالنسبة للفحص المجهري الفلوري ، قم بإزالة الشريحة التي تحتوي على قسم الحبل الشوكي ، وقم بعكس 25 ميكرولترا من DAPI المذاب في وسط التركيب. احتضان الأقسام عند أربع درجات مئوية لمدة 10 دقائق في الظلام لمنع التبييض.
بعد الحضانة ، استخدم مجهر الفلورسنت لتصوير جميع الشرائح. تخيل الشريحة الملطخة بالهيماتوكسيلين والإيوزين باستخدام مجهر ضوئي. يمكن رؤية الأوعية الدموية للحبل الشوكي بعد استئصال الصفيحة الفقرية ، وتظهر الوريد الشوكي الخلفي ، مع وجود أوعية أصغر متعددة تشع بشكل جانبي.
بعد الحقن الوريدي ل EBD ، ظهرت الأنسجة المحيطة والأوعية الدموية للحبل الشوكي باللون الأزرق. بعد صوتنة ، تصبح بقعة زرقاء مرئية فوق الموقع المستهدف ، مما يشير إلى تسرب EBD إلى الحمة البيضاء ، بسبب اضطراب BSCB. أكد استئصال الحبل الشوكي من الفئران باستخدام الموجات فوق الصوتية المركزة منخفضة الكثافة ، أو صوتنة LIFU ، تسرب واضح من EBD في الحبل الشوكي.
في حين أن الفئران ذات السيطرة السلبية دون علاج LIFU لم تظهر تسرب EBD. أظهرت الحبال الشوكية مع صوتنة LIFU كثافة أكبر بكثير من التألق الذاتي EBD ، من الحبال التي لم تتلق صوتنة. مع كثافة مماثلة من DAPI موجودة في كليهما.
كشف تحليل الهيماتوكسيلين ويوزين عن عدم وجود تلف عصبي أو نزيف أو آفات تجويف في المواقع الصوتية. يتم عرض أمثلة على الحبال المصابة بسبب سوء التعامل الجراحي ، وصوتنة عالية الطاقة كمقارنة. في الفئران التي تلقت الفقاعات الدقيقة وعلاج LIFU ، لم يلاحظ أي تغيير في درجات المحرك ، وما قبل صوتنة ، وما بعد صوتنة ، وخلال فترة البقاء على قيد الحياة لمدة خمسة أيام.
لوحظت تغييرات طفيفة في درجة حرارة الحبل الشوكي قبل وأثناء وبعد تحليل صوتنة. من المهم الحد من الأضرار الجراحية للحبل أثناء استئصال الصفيحة الفقرية. تصور المقاطع الملطخة H و E بالمجهر ، سيشير إلى ما إذا كان قد حدث أي ضرر.
بعد اضطراب حاجز الحبل الشوكي الدموي ، باستخدام الموجات فوق الصوتية المركزة ، يمكن حقن الحيوانات بعوامل مضادة للأورام ، أو علاجات جينية. ستحدد النتيجة ما إذا كانت هذه التقنية يمكن أن تحسن تقديم العلاجات ، وتطيل البقاء على قيد الحياة في وضع أمراض الحبل الشوكي.
النظرة العامة
يصف هذا البروتوكول طريقة لفتح الحاجز الدموي للحبل الشوكي (BSCB) بشكل مؤقت باستخدام فقاعات دقيقة وموجات فوق صوتية مركزة منخفضة الشدة (LIFU) في نموذج من القوارض. تسمح التقنية بتسليم العلاجات المستهدفة للحبل الشوكي، مع تأكيد تعطيل BSCB من خلال طرق بصرية.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلوم
- علم الأعصاب
- الهندسة الطبية الحيوية
- أنظمة التوصيل العلاجي
الخلفية
- الحاجز الدموي للحبل الشوكي هو بنية حرجة ذات نفاذية محدودة.
- يمكن أن يؤدي فتح الحاجز الدموي للحبل الشوكي إلى تحسين توصيل الأدوية لعلاجات الحبل الشوكي.
- تستخدم هذه الطريقة تقنية الموجات فوق الصوتية للتحديد الدقيق.
- يمكن تحقيق التأكيد البصري لتعطيل الحاجز من خلال الفحص المجهري.
هدف الدراسة
- تطوير طريقة آمنة وفعالة لتعطيل الحاجز الدموي للحبل الشوكي.
- استكشاف الإمكانات لتحسين توصيل العلاجات الجينية والأدوية.
- تقييم سلامة الإجراء في نموذج من القوارض.
الطرق المستخدمة
- إعطاء الميكروبات عن طريق الوريد.
- تطبيق موجات فوق صوتية مركزة منخفضة الشدة (LIFU).
- استخدام الفحص المجهري الفلوري لتصور تعطيل الحاجز الدموي للحبل الشوكي.
- تحليل نسيجي لأقسام الحبل الشوكي بعد الإجراء.
النتائج الرئيسية
- تم تأكيد فتح الحاجز الدموي للحبل الشوكي بنجاح عبر تسرب EBD.
- لم يتم ملاحظة أي تلف عصبي أو نزيف في الفئران المعالجة.
- تم ملاحظة توهج ذاتي أكبر بكثير لـ EBD في الحبل الشوكي الذي تم تعريضه للموجات فوق الصوتية.
- لم يتم اكتشاف أي تغييرات في الدرجات الحركية بعد تعريضها للموجات فوق الصوتية.
الاستنتاجات
- يفتح البروتوكول الحاجز الدموي للحبل الشوكي بشكل فعال دون التسبب في ضرر لأنسجة الحبل الشوكي.
- قد تحسن هذه الطريقة من التوصيل العلاجي لإصابات الحبل الشوكي.
- تبرر الدراسات الإضافية استكشاف التطبيقات السريرية.
الأسئلة الشائعة
Executive Industry Relevance
Transient and localized disruption of the blood-spinal cord barrier (BSCB) using low-intensity focused ultrasound (LIFU) enables targeted delivery of therapeutics to the spinal cord, addressing a critical bottleneck in CNS drug development. This protocol provides a reproducible and scalable method for evaluating BSCB permeability modulation, supporting preclinical assessment of delivery strategies for gene therapies and biologics. The approach enhances predictive confidence for translational programs targeting spinal cord pathologies.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of BSCB permeability as a mechanistic barrier to therapeutic access.
- Supports functional validation of delivery hypotheses for CNS-targeted agents.
- Facilitates biological de-risking by confirming localized and reversible barrier opening.
- Provides a platform for evaluating the impact of BSCB modulation on compound distribution.
Screening & Assay Development
- Establishes a validated small animal model for screening BSCB-opening parameters.
- Delivers reproducible, quantitative readouts via Evans Blue Dye extravasation and fluorescence microscopy.
- Enables standardization of sonication protocols for cross-study comparability.
- Supports downstream evaluation of drug or gene therapy penetration post-BSCB disruption.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with translational biomarker strategies by providing direct visualization of barrier opening.
- Enables continuity from discovery to preclinical validation for spinal cord drug delivery approaches.
- Supports risk-adjusted advancement of delivery technologies for spinal cord injury, tumor, or atrophy models.
- Facilitates mechanistic de-risking for immunomodulation and neuromodulation applications.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates into the discovery-to-preclinical continuum for CNS drug delivery, bridging early mechanistic studies and translational validation of therapeutic access to the spinal cord.
- Discovery Biology: Provides a platform for hypothesis testing on BSCB permeability and therapeutic distribution.
- Screening: Offers quantitative, reproducible outputs for optimizing sonication and microbubble parameters.
- Analytics: Enables direct measurement of barrier disruption via EBD extravasation and fluorescence intensity.
- Translational Research: Supports preclinical evaluation of delivery efficacy and safety in disease-relevant models.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable workflow for diverse CNS delivery and neuromodulation studies.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in CNS delivery strategies and reduces mechanistic ambiguity.
- Operational Value: Standardizes BSCB disruption protocols for reproducibility and scalability across studies.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions for CNS-targeted portfolios by enabling robust delivery assessment.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of delivery technologies and therapeutic candidates.
Implementation Considerations
- Requires expertise in focused ultrasound instrumentation and small animal surgery.
- Demands access to fluorescence microscopy and histological analysis infrastructure.
- Necessitates cross-team standardization of sonication and microbubble administration protocols.
- Adaptation may be needed for different animal models or spinal cord regions.
- Careful surgical technique is essential to minimize confounding tissue damage.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Introduction
1:11
Low‐Intensity Focused Ultrasound Assembly and Setup
2:20
Animal Preparation and Surgical Laminectomy
3:38
Target Localization Using Laser Guidance
4:22
Microbubble Administration
5:27
Spinal Cord Extraction, Tissue Processing, and Visualization of BSCB Disruption
6:34
Results: Confirmation of Target Localization and Evaluating BSCB Disruption by EBD Extravasation into the Spinal Cord
8:17
Conclusion
