التصوير في الموقع من الغدة الصعترية ماوس باستخدام الميكروسكوب 2 فوتون

يُعد التصوير ثنائي الفوتون مفيداً في علم المناعة لأنه يتيح لنا تتبع هجرة خلية واحدة أثناء تفاعلها مع بيئتها. ومن خلال تتبع الهجرة في موقع الغدة الزعترية وباستخدام المجهر ثنائي الفوتون، يمكننا توصيف آلية الانتقاء الإيجابي والسلبي.

مرحباً، أنا إينا لوتي من مختبر الدكتورة إلين روبي في جامعة كاليفورنيا في بيركلي. وأنا بول هيرزمارك، من مختبر إلين روبي أيضاً. سنوضح لكم اليوم كيفية إجراء التصوير الموضعي لأنسجة الغدة الزعترية، وسأعرض لكم كيف يمكننا استخدام مجهر الفوتونين لتصوير الغدة الزعترية.

وسأعرض لكم الخطوات التي تسبق التصوير ثنائي الفوتون. وتشمل هذه الخطوات الإجراءات التالية: عزل الخلايا الجذعية المكونة للدم من نخاع العظم، والنقل التبني للخلايا النخاعية إلى المواليد، وتشريح الغدة الزعترية وتقسيمها، وتجهيز النسيج للتصوير باستخدام المجهر الماسح الليزري ثنائي الفوتون. لذا، فلنبدأ.

قبل أن نتمكن من تحضير الغدة الزعترية للتصوير، يجب علينا أولاً إجراء نقل تبادلي لخلايا نخاع العظم إلى فأر حديث الولادة. تم عزل خلايا نخاع العظم هذه من الأرجل الخلفية لفئران معدلة وراثياً تعبر عن GFP بشكل منتشر. هذه حقنة أنسولين تحتوي على 50 µL من نخاع العظم.

نقوم بإجراء من حقنتين إلى أربع حقنات في مضيفين يتراوح عمرهما بين ثلاثة إلى سبعة أيام، باستخدام نخاع عظمي من متبرع واحد لكل جرو يتم حقنه. ولدينا هنا جرو عمره خمسة أيام، نقوم بشد الجلد للخلف لمنع الجرو من الحركة أثناء الحقن وللحفاظ على الجلد مشدوداً. استهدف موقع حقن يكون أسفل الرئتين والقفص الصدري، ولكن فوق الأمعاء والمعدة.

أثناء الحقن، قم بتخفيف قبضتك على الجلد للسماح له بالتمدد. وأخيرًا، اسحب المحقنة ببطء لتقليل كمية نخاع العظم المفقودة. تُترك هذه الفئران لتنمو لمدة تتراوح من أربعة إلى ستة أسابيع، ومن ثم يمكن إزالة الغدة الزعترية لأغراض التصوير.

بعد مرور أربعة إلى ستة أسابيع، يمكن إزالة الغدة الزعترية. من أجل التصوير، سأستخدم مجموعة من الملاقط والمقصات الكبيرة بالإضافة إلى مجموعة من الملاقط والمقصات الصغيرة. لقد تم التضحية بهذا الفأر وفقاً لبروتوكول استخدام الحيوانات الخاص بنا، وتم رشه بالإيثانول.

سأستخدم الملقط الكبير لقرص الجلد وإجراء شق في الخط الناصف. الآن يمكنني إما استخدام المقص للقص على طول الخط الناصف أو تمزيق الجلد بعيداً عن الصفاق، وسأقوم بتثبيت الجلد للكشف عن تجويف الصدر. وسأستخدم عظم القص للإمساك به أثناء القص عبر الصفاق والدخول إلى تجويف الصدر من خلال الحجاب الحاجز، ثم القص على طول جوانب القفص الصدري.

ويمكنكم رؤية الغدة الزعترية وهي تقع مباشرة فوق القلب. سأقوم بإعادتها إلى مكانها. هذه هي الغدة الزعترية.

سأتجنب لمسه. استخدم الملقط الأصغر، واستمر في تثبيت الأنسجة المحيطة بالغدة الزعترية. حسنًا، الآن سأقوم برشها ببعض الـ PBS والبدء في إزالة بعض الأنسجة الزائدة.

لذا سأستخدم الأنسجة المحيطة بالغدة الزعترية للإمساك بها. وعند تنظيف الغدة الزعترية، سأقوم بإزالة الأنسجة الزائدة عن طريق قصها بعناية. والآن، هناك فصان في الغدة الزعترية يتعين علينا أيضاً فصلهما أثناء عملية التنظيف.

لكن أولاً، سأقوم بإزالة جميع هذه الأوعية الدموية الإضافية الموجودة على سطح الغدة الزعترية. سأكون حريصاً جداً على عدم إزعاج بنية الغدة الزعترية التي سنقوم بتصويرها، لذا سأقوم فقط بسحب الأنسجة الموجودة على السطح مباشرة.

سأبدأ الآن بفصل الفصين برفق. هذا هو الفص البطني والفص الظهري اللذان سنقوم بفصلهما، مع قطع الأنسجة بلطف ومباعدتهما. لا نريد للأنسجة أن تجف، لذا سنقوم برش القليل من PBS عليها.

لقد قمت الآن بفصل الفصين. هذا هو الفص الظهري، والذي يتميز بشكل يشبه الجيتار. وهذا هو الفص البطني هنا.

سأقوم بإزالة الأنسجة الزائدة من كل فص من هذه الفصوص بحيث تكون منطقة التصوير خالية من أي أنسجة زائدة. ولكن سأترك جزءاً بسيطاً من الأنسجة لنتمكن من الإمساك بها. فعند إجراء التصوير، سنقوم بالتصوير من خلال هذه الأنسجة الزائدة، وهو أمر غير ضروري حقاً، لذا فإن إزالتها ستؤدي إلى تحسين جودة الصورة.

لقد حصلنا الآن على الفصين المنقسمين واللذين أصبحا جاهزين للتثبيت على غطاء شريحة من أجل التصوير. ومن أجل تحضير الغدة الزعترية المنقسمة للتصوير، ستحتاج إلى لاصق أنسجة بيطري وأغطية شرائح مقاس 18 × 18. أفضل استخدام ماصة دقيقة لوضع جزء من الميكرولتر من الغراء على غطاء الشريحة.

سأضع قطرة من الغراء بطول يقارب طول الغدة الزعترية التي سنقوم بتصويرها. ثم أفضل توزيعها على المساحة. وإذا كانت بعرض الغدة الزعترية، سأضع كلا الفصين على نفس الشريحة الغطائية.

لذا، سأضع فصاً آخر هنا. سأقوم بالتقاط الفص من النسيج الزائد وأضعه ببساطة على شريحة التغطية، ثم أسحبه إلى المنطقة التي يوجد بها الغراء. سأفعل الشيء نفسه مع الفص الآخر، حيث ألمسه مرة أخرى مقابل شريحة التغطية في منطقة خالية من الغراء لتثبيت يدي، ثم أضع الفص الغدي الصدري الآخر على شريحة التغطية.

الآن بعد أن قمنا بتثبيت كلتا الكرتين thymic على غطاء الشريحة، سنقوم بتسليمه إلى بول للتصوير. شكراً يا إينا. دعونا نأخذ هذه العينة ونضعها في وسط DME الذي سنستخدمه لتصويرها.

هذا هو إعداد مجهر الفوتونين الخاص بنا. يُعد مجهر الفوتونين فعالاً جداً في تصوير الخلايا المناعية لأنه يتيح لك النظر في عمق الغدة الزعترية ورؤية الخلايا الفلورية وهي تتحرك. وهو يستخدم ليزر الأشعة تحت الحمراء النبضي لجعل الخلايا تتفلور.

ولدينا في مجهرنا ذو الحزام المنزلي أربع كاميرات مختلفة تسمح لنا بتصوير أربعة ألوان مختلفة في آن واحد، وتستخدم عدسة شيئية خاصة بتكبير 20 x. وهي عدسة خاصة تُغمر في وسط DMEM الذي غمرنا فيه الغدة الزعترية، مما يمنحها فتحة عددية (na) تبلغ 0.95، وهو أمر جيد جداً سيجعل خلايانا ساطعة للغاية. ومن أجل الحفاظ على صحة النسيج، نقوم بضخ فقاعات من 95% oxygen و 5% CO2 عبر وسط DMEM.

من هناك، يتم ضخ السائل إلى غرفة التروية حيث يتم تسخينه إلى 37 درجة، وهناك تُغمر فصوص الغدة الزعترية. وبواسطة هذا النظام، يمكننا الحفاظ على صحة الخلايا في الغدة الزعترية لمدة أربع ساعات من التصوير. لقد أوضحت لكم كيفية إعداد التصوير باستخدام مجهر الفوتونين.

دعونا الآن نستعرض بعض نتائجنا في هذا المقطع المرئي المتكرر. يمكنك رؤية الغدة الزعترية التي قمنا بتصويرها بأربعة ألوان مختلفة هنا. تمثل المناطق الحمراء الأوعية الدموية في الغدة الزعترية، بينما تمثل المناطق الصفراء الخلايا التغصنية من المضيف التي تعبر عن البروتين الفلوري الأصفر تحت تحكم محفز محدد للخلايا التغصنية.

إن الخلايا التيموسية الزرقاء والخضراء التي تراها هنا مأخوذة من متبرعين مختلفين استخدمناهما لإنشاء كيميرا حديثة الولادة باستخدام تقنية النقل التبني الذي عرضته لك إينا سابقاً. الخلايا الخضراء هي خلايا تيموسية تعبر عن البروتين الفلوري الأخضر، بينما الخلايا الزرقاء هي خلايا تيموسية من المتبرع الذي كان يعبر عن البروتين الفلوري السماوي. هذا هو نفس المقطع المرئي المتكرر الذي عرضته لك من قبل، ولكنني أريد أن أريك الأبعاد الثلاثية لمجموعات البيانات التي نجمعها للحصول على هذه المقاطع.

نقوم بضبط التركيز على مستوى معين ونلتقط صورة، ثم نضبط التركيز لعمق أكبر قليلاً ونلتقط صورة أخرى، وهكذا نكرر العملية لعمق أكبر في صورة تالية. وبالنسبة لهذا المقطع المرئي، فقد تعمقنا بنحو 60 microns، ثم كررنا التقاط هذا الحجم من الصور مرة كل 30 seconds تقريباً للحصول على الحجم المتحرك. وقد تم تصوير هذا المقطع على مدار 20 minutes تقريباً.

وبذلك يمكننا تتبع الخلايا عبر ثلاثة أبعاد بمرور الوقت. لقد عرضنا لكم للتو كيفية تصوير الغدة الزعترية باستخدام المجهر الفوتوني. وتتمثل أهم جوانب هذا الإجراء في: أولاً، حقن المواليد بنخاع العظام من المتبرعين.

ثانياً، تشريح الغدة الزعترية دون إتلاف بنيتها. ثالثاً، تثبيت الغدة الزعترية بإحكام على شريحة غطاء زجاجية رابعاً للتصوير باستخدام مجهر ثنائي الفوتون. يمكن أن يجيب التصوير في الغدة الزعترية عن العديد من التساؤلات حول تطور الخلايا الزعترية وتوليد مجموعة متنوعة من الخلايا التائية.

هذا كل شيء. نشكركم على المشاهدة وتمنياتنا لكم بالتوفيق في تجاربكم.