التصوير في الموقع من الغدة الصعترية ماوس باستخدام الميكروسكوب 2 فوتون

يعد تصوير الفوتون مفيدا لعلم المناعة لأنه يسمح لنا بمتابعة هجرة خلية واحدة أثناء مواجهتها لبيئتها. باتباع ترحيل موقع الغدة الصعترية. باستخدام اثنين من المجهري الفوتوني ، يمكننا توصيف آلية الانتقاء الإيجابي والسلبي.

مرحبا ، أنا إينا لوتي من مختبر الدكتورة إلين روبي في جامعة كاليفورنيا في بيركلي. وأنا بول هيرزمارك ، أيضا من مختبر إلين روبي. سنوضح لكم اليوم كيف نقوم بالتصوير الموضعي لأنسجة الغدة الصعترية، وسأوضح لكم كيف يمكننا استخدام المجهر الفوتوني لتصوير الغدة الصعترية.

وسأريكم الخطوات التي تؤدي إلى تصوير الفوتونين. ويشمل ذلك الإجراءات التالية ، عزل الخلايا الجذعية المكونة للدم من النقل بالتبني لنخاع العظم لنخاع العظم إلى حديثي الولادة ، وتشريح ، وتقسيم الغدة الصعترية ، وإعداد الأنسجة للتصوير بواسطة منظارين مجهريين للمسح الضوئي بالليزر. لذلك دعونا نبدأ.

قبل أن نتمكن من تحضير الغدة الصعترية للتصوير ، يجب علينا أولا نقل خلايا نخاع العظم بالتبني إلى فأر حديثي الولادة. تم عزل خلايا نخاع العظم هذه من الأرجل الخلفية للفئران المعدلة وراثيا التي تعبر عن GFP في كل مكان. هذه حقنة أنسولين تحتوي على 50 ميكرولتر من نخاع العظام.

نقوم بإجراء حقنتين إلى أربع حقن في العوائل التي يتراوح عمرها من ثلاثة إلى سبعة أيام ، باستخدام نخاع عظم من متبرع واحد لكل جرو يتم حقنه. وهنا لدينا جرو يبلغ من العمر خمسة أيام ، اضغط على الجلد للخلف لمنع الجرو من الحركة أثناء الحقن وللحفاظ على الجلد مرتفعا. استهدف موقع الحقن أسفل الرئتين والقفص الصدري ، ولكن فوق الأمعاء والمعدة.

أثناء الحقن ، قم بفك قبضتك على الجلد للسماح له بالتمدد. أخيرا ، قم بإزالة المحقنة ببطء للحد من كمية نخاع العظم المفقودة. سيسمح لهذه الفئران بالتطور لمدة أربعة إلى ستة أسابيع ، وبعد ذلك يمكن إزالة الغدة الصعترية للتصوير.

بعد أربعة إلى ستة أسابيع ، يمكن إزالة الغدة الصعترية. للتصوير ، سأستخدم مجموعة من الملقط والمقصات الكبيرة بالإضافة إلى مجموعة من الملقط والمقصات الصغيرة. لذلك تم التضحية بهذه الكتلة وفقا لبروتوكول استخدام الخاص بنا ورشها بالإيثانول.

وسأستخدم الملقط الكبير لقرص الجلد وعمل شق في خط الوسط. الآن يمكنني إما استخدام المقص لقطع خط الوسط أو يمكنني تمزيق الجلد بعيدا عن الصفاق وسأقوم بتثبيت الجلد لفضح تجويف الصدر. وسأستخدم القص للتمسك به بينما أقطع الصفاق وأذهب إلى تجويف الصدر من خلال الحجاب الحاجز ثم أقطع على طول جوانب القفص الصدري.

ويمكنك رؤية الغدة الصعترية ملقاة فوق القلب مباشرة. سأعيدهم. إذن هناك الغدة الصعترية.

سأتجنب لمسها. يمكنك استخدام ملقط أصغر ، ولا تزال تمسك بالأنسجة المحيطة بالغدة الصعترية. حسنا ، سأقوم الآن برشها ببعض PBS وأبدأ في إزالة بعض الأنسجة الزائدة.

لذلك سأستخدم الأنسجة المحيطة بالغدة الصعترية للتمسك بها. عندما أقوم بتنظيف الغدة الصعترية ، سأقوم بخلع الأنسجة الزائدة ، وأقصها بعناية. يوجد الآن فصتان في الغدة الصعترية يتعين علينا أيضا فصلهما أثناء تنظيفها.

لكن أولا سأقوم بإزالة كل هذه الأوعية الدموية الزائدة الموجودة على سطح الغدة الصعترية. أنا حريص جدا على عدم إزعاج بنية الغدة الصعترية التي سنقوم بتصويرها. لذلك أنا فقط أقوم بسحب الأنسجة الموجودة على السطح مباشرة.

الآن سأبدأ بلطف في فصل الفصين. هذا هو الفص البطني والفص الظهري الذي سنفصله ونقطعه بلطف ونفصلهما عن بعضهما البعض. لا نريد أن تجف الأنسجة ، لذلك سنرش القليل من PBS عليها.

الآن قمت بفصل الفصين. إذن هذا هو الفص الظهري ، الذي له شكل جيتار مميز. وهذا هو الفص البطني هنا.

سأقوم بتنظيف الأنسجة الزائدة من كل من هذه الفصوص بحيث تكون منطقة التصوير خالية من الأنسجة الزائدة. لكنني سأترك القليل من الأنسجة لنا للتمسك بالثيس. عندما نقوم بالتصوير، سنقوم بالتصوير من خلال هذه الأنسجة الزائدة، وهو أمر غير ضروري حقا، وسوف يحسن جودة صورتنا عن طريق إزالتها.

حتى الآن لدينا فصين مقسمين جاهزين للتركيب على زلة غطاء للتصوير. من أجل تحضير الغدة الصعترية المنقسمة للتصوير ، ستحتاج إلى بعض لاصق الأنسجة البيطرية وزلات غطاء 18 × 18. أحب استخدام أنبوب بيتمان لوضع جزء بسيط من ميكرولتر من الغراء على زلة الغطاء.

لذا سأضع قطرة من الغراء بطول الغدة الصعترية التي سنقوم بتصويرها. ثم أحب أن أنشرها. لذا إذا كان عرض الغدة الصعترية ، مرة أخرى ، سأضع كلا الفصين على نفس زلة الغطاء.

لذلك سأضع واحدة أخرى هنا. لذلك سألتقط الفص من الأنسجة الزائدة وأضعه على زلة الغطاء ثم أسحبه إلى المنطقة التي يوجد بها الغراء. سأفعل الشيء نفسه مع الفص الآخر ، مرة أخرى ، ألمس زلة الغطاء حيث لا يوجد غراء لتثبيت يدي ثم وضع الكرة الصعترية الأخرى على زلة الغطاء.

الآن بعد أن أرفقنا كلا الكرات الكريمة الصعترية بقلة الغلاف ، سننقلها إلى بول للتصوير. شكرا لك إينا. لنأخذ هذه العينة ونضعها في وسيط DME الذي سنستخدمه لتصويره.

إذن هذا هو إعداد مجهر الفوتونين. يعد الفحص المجهري للفوتونين مفيدا جدا لتصوير الخلايا المناعية لأنه يمكنك النظر بعمق في الغدة الصعترية ورؤية الخلايا الفلورية تتحرك. يستخدم ليزر الأشعة تحت الحمراء النبضي لجعل الخلايا تتألق.

ولدينا في مجهر الحزام المنزلي لدينا أربع كاميرات مختلفة تسمح لنا بتصور أربعة ألوان مختلفة في وقت واحد وتستخدم عدسة موضوعية خاصة ، وهي تكبير 20 ضعفا. وهي عدسة خاصة تغمس في وسط DME الذي غمرناه فيه الغدة الصعترية ، وهذا يسمح لها بالحصول على 0.95 NA ، وهو أمر جيد جدا ، سيجعل خلايانا ساطعة للغاية. من أجل الحفاظ على صحة الأنسجة ، نقوم بتفريغ 95٪ أكسجين و 5٪ CO2 من خلال وسط DMEM.

من هناك ، يتم ضخها إلى غرفة التروية حيث يتم تسخينها إلى 37 درجة ، وهذا هو المكان الذي يتم فيه غمر فصوص الغدة الصعترية. باستخدام هذا النظام ، يمكننا الحفاظ على صحة الخلايا في الغدة الصعترية لمدة أربع ساعات من التصوير. لذلك أوضحت لكم كيفية إعداد التصوير لمجهر الفوتونين.

الآن دعونا نلقي نظرة على بعض نتائجنا في هذا الفيلم الذي يتم تكراره. يمكنك رؤية الغدة الصعترية التي صورناها بأربعة ألوان مختلفة هنا. الأحمر عبارة عن أوعية دموية من الغدة الصعترية والأصفر عبارة عن خلايا متغصنة من المضيف تعبر عن بروتين الفلورسنت الأصفر تحت سيطرة محفز خاص بالخلايا المتغصنة.

الخلايا الزعترية الزرقاء والخضراء التي تراها هنا هي من متبرعين مختلفين نستخدمهما لعمل وهم حديثي الولادة باستخدام تقنية النقل بالتبني التي أظهرتها إينا لك سابقا. الخلايا الخضراء هي الخلايا الزعترية التي تعبر عن بروتين الفلورسنت الأخضر ، والخلايا الزرقاء هي الخلايا الزعترية من الدونات التي كانت تعبر عن بروتين الفلورسنت السماوي. هذا هو نفس الفيلم المتكرر الذي عرضته عليكم من قبل، لكنني أريد أن أريكم الأبعاد الثلاثة لمجموعات البيانات التي نجمعها للحصول على هذه الأفلام.

نركز على الطائرة ونلتقط صورة ثم نركز بشكل أعمق قليلا ونلتقط صورة أخرى وأعمق قليلا في صورة أخرى. ثم بالنسبة لهذا الفيلم ، انخفضنا حوالي 60 ميكرون ، ثم كررنا هذا الحجم من الصور مرة واحدة كل 30 ثانية تقريبا للحصول على الحجم المتحرك. وتم التقاط هذا الفيلم على مدار حوالي 20 دقيقة.

حتى نتمكن من تتبع الخلايا من خلال ثلاثة أبعاد بمرور الوقت. لقد أوضحنا لك للتو كيف نصور الغدة الصعترية باستخدام منظارين مجهريين للصور. أهم جوانب هذا الإجراء هي واحدة ، حقن حديثي الولادة بنخاع العظم من المتبرعين.

ثانيا ، تشريح وثنائي ، تشريح الغدة الصعترية دون الإضرار بهيكلها. ثلاثة ، ربط الغدة الصعترية بإحكام بغطاء زجاجي أربعة تصوير باستخدام مجهر فوتونين. يمكن أن يجيب التصوير في الغدة الصعترية على العديد من الأسئلة حول تطور الخلايا الزعترية وتوليد ذخيرة متنوعة من الخلايا التائية.

هذا كل شيء. شكرا لك على المشاهدة ونتمنى لك السعادة في تجاربك.