Name: التصوير في الموقع من الغدة الصعترية ماوس باستخدام الميكروسكوب 2 فوتون (فيديو) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-01-25T19:52:00.000+00:00
Duration: 15 min
Description: تعلم تصوير الغدة الصعترية في الموقع باستخدام الميكروسكوب ثنائي الفوتون لدراسة هجرة الخلايا في الفئران. يُمكّن هذا البروتوكول الباحثين من مراقبة ديناميكيات الخلايا التائية حية.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

نشكر مات بول وجيمي وو للمساعدة التقنية.

نقل بالتبني حقن الولدان مع 50 100ul من نخاع العظام باستخدام حقنة الانسولين 2-4 مرات خلال الأيام 3-7 الأولى من الحياة ، مع نسبة المانحة إلى المضيف النهائي 1:1. تهدف لموقع الحقن تحت القص والقفص الصدري ، ولكن قبل الأمعاء والمعدة. ادخال الإبرة بعيدا بما فيه الكفاية لاختراق الغشاء البريتوني ، الحرص على عدم ثقب في الحجاب الحاجز. ليس من غير المألوف أن يكون لفقدان بعض من نخاع العظم خلال الحقن. يمكنك تقليل الخسائر من خلال تخفيف قبضة الخاص بك على الجرو كما كنت حقن بحيث يسمح للجلد لتوسيع و، ثم ، وإزالة الإبرة ببطء. تشريح الغدة الصعترية إجراء شق طريق خط الوسط وقطع أو تمزق الجلد بعيدا لكشف القفص الصدري. الابقاء على القص وقطع طريق الصفاق والحجاب الحاجز. تقطيع جانبي القفص الصدري لكشف التجويف الصدري. الغدة الصعترية تقع على الجزء العلوي من القلب. وذلك للحفاظ على بنية الغدة الصعترية ، الابقاء على الأنسجة المحيطة بها كما كنت تشريح الغدة الصعترية. شطف التوتة مع برنامج تلفزيوني للحفاظ عليه من الجفاف أثناء تشريح. ندف بلطف بعيدا الأنسجة الزائدة على سطح الكبسولة التوتة وشطر من فصين اثنين. تستعد لتصوير الأنسجة استخدام البيطري لاصق الأنسجة لالغراء الغدة الصعترية لا للساترة مربع. استخدام pipetteman لوضع جزء من ميكروليتر من مادة لاصقة. نشر الغراء على طول وعرض تقريبي الغدة الصعترية. مطرد الغدة الصعترية ضد ساترة وجرها الى المكان. ثنائي الفوتون التصوير الغارقة في النسيج DMEM دون الحمراء الفينول التي perfused مع الأكسجين 95 ٪ و 5 ٪ ثاني أكسيد الكربون ودرجة حرارة إلى 37 درجة مئوية. وقد تحقق الإثارة ثنائي الفوتون باستخدام الأطياف ، فيزياء الليزر MaiTai ضبطها ل900nm ، وCFP ، GFP ، YFP وتكساس الضوء الأحمر فصلت الانبعاثات باستخدام 495 ، 515 ، 560 المرايا مزدوج اللون ، والتي تم جمعها باستخدام كاشفات PMT.

<ol><li>Kyewski, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Seeding+of+thymic+microenvironments+defined+by+distinct+thymocyte-stromal+cell+interactions+is+developmentally+controlled%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Seeding of thymic microenvironments defined by distinct thymocyte-stromal cell interactions is developmentally controlled.</a> J Exp Med. 166, 520-538 (1987).</li>
<li>Ladi, E., Yin, X., Chtanova, T., Robey, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thymic+microenvironments+for+T+cell+differentiation+and+selection%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">Thymic microenvironments for T cell differentiation and selection.</a> Nat Immunol. 7, 338-343 (2006).</li>
<li>Witt, C. M., Raychaudhuri, S., Schaefer, B., Chakraborty, A. K., Robey, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+Migration+of+Positively+Selected+Thymocytes+Visualized+in+Real+Time%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Directed Migration of Positively Selected Thymocytes Visualized in Real Time.</a> PLoS Biol. 3, (2005).</li>
</ol>

ليس لدى المؤلفين أي تضارب مصالح للإفصاح عنه.

التصوير ثنائي الفوتون في الغدة الصعترية تمكننا من النظر في الهيئات ، الذين يعيشون على حالها والتفاعلات والأحداث التي تكمن وراء الهجرات الاختيار داخل الغدة الصعترية.

التصوير في الموقع من الغدة الصعترية ماوس باستخدام الميكروسكوب 2 فوتون

In situ Imaging of the Mouse Thymus Using 2-Photon Microscopy

الميكروسكوب ثنائي الفوتون (TPM) يتيح لنا صورة عميقة في الغدة الصعترية وتوثيق الأحداث التي تعتبر مهمة لتطوير خلية توتية. لمتابعة هجرة الأفراد في حشد من thymocytes ، فإننا توليد الوهم حديثي الولادة حيث يتم استخلاص أقل من واحد في المئة من thymocytes من الجهات المانحة التي تم المعدلة وراثيا لبروتين فلوري أعرب بتواجد مطلق. لإنشاء هذه الجزئية hematopoetic الوهم ، يتم حقن الأطفال حديثي الولادة مع متلقي نخاع العظم بين 3-7 أيام من العمر. بعد 4-6 أسابيع ، يتم التضحية الماوس ويتم تشريح بعناية التوتة bissected والحفاظ على بنية النسيج التي سيتم تصويرها. يتم لصقها الغدة الصعترية في الصعود إلى ساترة استعدادا للخارج الجسم بواسطة التصوير TPM. أثناء التصوير يتم الاحتفاظ بها في الغدة الصعترية DMEM دون الحمراء الفينول التي perfused مع الأكسجين 95 ٪ و 5 ٪ ثاني أكسيد الكربون ودرجة حرارة إلى 37 درجة مئوية. باستخدام هذا النهج ، يمكننا دراسة الأحداث اللازمة لجيل من ذخيرة متنوعة الخلايا التائية.

نقدم خطوة بخطوة تعليمات لتوليد الوهم حديثي الولادة ، فضلا عن تشريح وإعداد الغدة الصعترية لخارج الجسم بواسطة التصوير 2 - فوتون الميكروسكوب.

يتيح لنا المجهر ثنائي الفوتون (TPM) تصوير أعماق الغدة الزعترية وتوثيق الأحداث الهامة لتطور الخلايا الزعترية. ولمتابعة...

يُعد التصوير ثنائي الفوتون مفيداً في علم المناعة لأنه يتيح لنا تتبع هجرة خلية واحدة أثناء تفاعلها مع بيئتها. ومن خلال تتبع الهجرة في موقع الغدة الزعترية وباستخدام المجهر ثنائي الفوتون، يمكننا توصيف آلية الانتقاء الإيجابي والسلبي.مرحباً، أنا إينا لوتي من مختبر الدكتورة إلين روبي في جامعة كاليفورنيا في بيركلي. وأنا بول هيرزمارك، من مختبر إلين روبي أيضاً. سنوضح لكم اليوم كيفية إجراء التصوير الموضعي لأنسجة الغدة الزعترية، وسأعرض لكم كيف يمكننا استخدام مجهر الفوتونين لتصوير الغدة الزعترية.وسأعرض لكم الخطوات التي تسبق التصوير ثنائي الفوتون. وتشمل هذه الخطوات الإجراءات التالية: عزل الخلايا الجذعية المكونة للدم من نخاع العظم، والنقل التبني للخلايا النخاعية إلى المواليد، وتشريح الغدة الزعترية وتقسيمها، وتجهيز النسيج للتصوير باستخدام المجهر الماسح الليزري ثنائي الفوتون. لذا، فلنبدأ.قبل أن نتمكن من تحضير الغدة الزعترية للتصوير، يجب علينا أولاً إجراء نقل تبادلي لخلايا نخاع العظم إلى فأر حديث الولادة. تم عزل خلايا نخاع العظم هذه من الأرجل الخلفية لفئران معدلة وراثياً تعبر عن GFP بشكل منتشر. هذه حقنة أنسولين تحتوي على 50 µL من نخاع العظم.نقوم بإجراء من حقنتين إلى أربع حقنات في مضيفين يتراوح عمرهما بين ثلاثة إلى سبعة أيام، باستخدام نخاع عظمي من متبرع واحد لكل جرو يتم حقنه. ولدينا هنا جرو عمره خمسة أيام، نقوم بشد الجلد للخلف لمنع الجرو من الحركة أثناء الحقن وللحفاظ على الجلد مشدوداً. استهدف موقع حقن يكون أسفل الرئتين والقفص الصدري، ولكن فوق الأمعاء والمعدة.أثناء الحقن، قم بتخفيف قبضتك على الجلد للسماح له بالتمدد. وأخيرًا، اسحب المحقنة ببطء لتقليل كمية نخاع العظم المفقودة. تُترك هذه الفئران لتنمو لمدة تتراوح من أربعة إلى ستة أسابيع، ومن ثم يمكن إزالة الغدة الزعترية لأغراض التصوير.بعد مرور أربعة إلى ستة أسابيع، يمكن إزالة الغدة الزعترية. من أجل التصوير، سأستخدم مجموعة من الملاقط والمقصات الكبيرة بالإضافة إلى مجموعة من الملاقط والمقصات الصغيرة. لقد تم التضحية بهذا الفأر وفقاً لبروتوكول استخدام الحيوانات الخاص بنا، وتم رشه بالإيثانول.سأستخدم الملقط الكبير لقرص الجلد وإجراء شق في الخط الناصف. الآن يمكنني إما استخدام المقص للقص على طول الخط الناصف أو تمزيق الجلد بعيداً عن الصفاق، وسأقوم بتثبيت الجلد للكشف عن تجويف الصدر. وسأستخدم عظم القص للإمساك به أثناء القص عبر الصفاق والدخول إلى تجويف الصدر من خلال الحجاب الحاجز، ثم القص على طول جوانب القفص الصدري.ويمكنكم رؤية الغدة الزعترية وهي تقع مباشرة فوق القلب. سأقوم بإعادتها إلى مكانها. هذه هي الغدة الزعترية.سأتجنب لمسه. استخدم الملقط الأصغر، واستمر في تثبيت الأنسجة المحيطة بالغدة الزعترية. حسنًا، الآن سأقوم برشها ببعض الـ PBS والبدء في إزالة بعض الأنسجة الزائدة.لذا سأستخدم الأنسجة المحيطة بالغدة الزعترية للإمساك بها. وعند تنظيف الغدة الزعترية، سأقوم بإزالة الأنسجة الزائدة عن طريق قصها بعناية. والآن، هناك فصان في الغدة الزعترية يتعين علينا أيضاً فصلهما أثناء عملية التنظيف.لكن أولاً، سأقوم بإزالة جميع هذه الأوعية الدموية الإضافية الموجودة على سطح الغدة الزعترية. سأكون حريصاً جداً على عدم إزعاج بنية الغدة الزعترية التي سنقوم بتصويرها، لذا سأقوم فقط بسحب الأنسجة الموجودة على السطح مباشرة.سأبدأ الآن بفصل الفصين برفق. هذا هو الفص البطني والفص الظهري اللذان سنقوم بفصلهما، مع قطع الأنسجة بلطف ومباعدتهما. لا نريد للأنسجة أن تجف، لذا سنقوم برش القليل من PBS عليها.لقد قمت الآن بفصل الفصين. هذا هو الفص الظهري، والذي يتميز بشكل يشبه الجيتار. وهذا هو الفص البطني هنا.سأقوم بإزالة الأنسجة الزائدة من كل فص من هذه الفصوص بحيث تكون منطقة التصوير خالية من أي أنسجة زائدة. ولكن سأترك جزءاً بسيطاً من الأنسجة لنتمكن من الإمساك بها. فعند إجراء التصوير، سنقوم بالتصوير من خلال هذه الأنسجة الزائدة، وهو أمر غير ضروري حقاً، لذا فإن إزالتها ستؤدي إلى تحسين جودة الصورة.لقد حصلنا الآن على الفصين المنقسمين واللذين أصبحا جاهزين للتثبيت على غطاء شريحة من أجل التصوير. ومن أجل تحضير الغدة الزعترية المنقسمة للتصوير، ستحتاج إلى لاصق أنسجة بيطري وأغطية شرائح مقاس 18 × 18. أفضل استخدام ماصة دقيقة لوضع جزء من الميكرولتر من الغراء على غطاء الشريحة.سأضع قطرة من الغراء بطول يقارب طول الغدة الزعترية التي سنقوم بتصويرها. ثم أفضل توزيعها على المساحة. وإذا كانت بعرض الغدة الزعترية، سأضع كلا الفصين على نفس الشريحة الغطائية.لذا، سأضع فصاً آخر هنا. سأقوم بالتقاط الفص من النسيج الزائد وأضعه ببساطة على شريحة التغطية، ثم أسحبه إلى المنطقة التي يوجد بها الغراء. سأفعل الشيء نفسه مع الفص الآخر، حيث ألمسه مرة أخرى مقابل شريحة التغطية في منطقة خالية من الغراء لتثبيت يدي، ثم أضع الفص الغدي الصدري الآخر على شريحة التغطية.الآن بعد أن قمنا بتثبيت كلتا الكرتين thymic على غطاء الشريحة، سنقوم بتسليمه إلى بول للتصوير. شكراً يا إينا. دعونا نأخذ هذه العينة ونضعها في وسط DME الذي سنستخدمه لتصويرها.هذا هو إعداد مجهر الفوتونين الخاص بنا. يُعد مجهر الفوتونين فعالاً جداً في تصوير الخلايا المناعية لأنه يتيح لك النظر في عمق الغدة الزعترية ورؤية الخلايا الفلورية وهي تتحرك. وهو يستخدم ليزر الأشعة تحت الحمراء النبضي لجعل الخلايا تتفلور.ولدينا في مجهرنا ذو الحزام المنزلي أربع كاميرات مختلفة تسمح لنا بتصوير أربعة ألوان مختلفة في آن واحد، وتستخدم عدسة شيئية خاصة بتكبير 20 x. وهي عدسة خاصة تُغمر في وسط DMEM الذي غمرنا فيه الغدة الزعترية، مما يمنحها فتحة عددية (na) تبلغ 0.95، وهو أمر جيد جداً سيجعل خلايانا ساطعة للغاية. ومن أجل الحفاظ على صحة النسيج، نقوم بضخ فقاعات من 95% oxygen و 5% CO2 عبر وسط DMEM.من هناك، يتم ضخ السائل إلى غرفة التروية حيث يتم تسخينه إلى 37 درجة، وهناك تُغمر فصوص الغدة الزعترية. وبواسطة هذا النظام، يمكننا الحفاظ على صحة الخلايا في الغدة الزعترية لمدة أربع ساعات من التصوير. لقد أوضحت لكم كيفية إعداد التصوير باستخدام مجهر الفوتونين.دعونا الآن نستعرض بعض نتائجنا في هذا المقطع المرئي المتكرر. يمكنك رؤية الغدة الزعترية التي قمنا بتصويرها بأربعة ألوان مختلفة هنا. تمثل المناطق الحمراء الأوعية الدموية في الغدة الزعترية، بينما تمثل المناطق الصفراء الخلايا التغصنية من المضيف التي تعبر عن البروتين الفلوري الأصفر تحت تحكم محفز محدد للخلايا التغصنية.إن الخلايا التيموسية الزرقاء والخضراء التي تراها هنا مأخوذة من متبرعين مختلفين استخدمناهما لإنشاء كيميرا حديثة الولادة باستخدام تقنية النقل التبني الذي عرضته لك إينا سابقاً. الخلايا الخضراء هي خلايا تيموسية تعبر عن البروتين الفلوري الأخضر، بينما الخلايا الزرقاء هي خلايا تيموسية من المتبرع الذي كان يعبر عن البروتين الفلوري السماوي. هذا هو نفس المقطع المرئي المتكرر الذي عرضته لك من قبل، ولكنني أريد أن أريك الأبعاد الثلاثية لمجموعات البيانات التي نجمعها للحصول على هذه المقاطع.نقوم بضبط التركيز على مستوى معين ونلتقط صورة، ثم نضبط التركيز لعمق أكبر قليلاً ونلتقط صورة أخرى، وهكذا نكرر العملية لعمق أكبر في صورة تالية. وبالنسبة لهذا المقطع المرئي، فقد تعمقنا بنحو 60 microns، ثم كررنا التقاط هذا الحجم من الصور مرة كل 30 seconds تقريباً للحصول على الحجم المتحرك. وقد تم تصوير هذا المقطع على مدار 20 minutes تقريباً.وبذلك يمكننا تتبع الخلايا عبر ثلاثة أبعاد بمرور الوقت. لقد عرضنا لكم للتو كيفية تصوير الغدة الزعترية باستخدام المجهر الفوتوني. وتتمثل أهم جوانب هذا الإجراء في: أولاً، حقن المواليد بنخاع العظام من المتبرعين.ثانياً، تشريح الغدة الزعترية دون إتلاف بنيتها. ثالثاً، تثبيت الغدة الزعترية بإحكام على شريحة غطاء زجاجية رابعاً للتصوير باستخدام مجهر ثنائي الفوتون. يمكن أن يجيب التصوير في الغدة الزعترية عن العديد من التساؤلات حول تطور الخلايا الزعترية وتوليد مجموعة متنوعة من الخلايا التائية.هذا كل شيء. نشكركم على المشاهدة وتمنياتنا لكم بالتوفيق في تجاربكم.

in-situ-imaging-of-the-mouse-thymus-using-2-photon-microscopy

Research

JoVE Journal

Biology

علم الأحياء

وكشف اثنان الفوتون التصوير حركية اللمفاويات والتفاعلات الخلوية داخل العقدة الليمفاوية في ظل ظروف والقاعدية خلال استجابة مناعية 1. هنا ، علينا أن نظهر نقل بالتبني من الخلايا التائية ، والعزلة من العقد الليمفاوية ، والحركة التصوير من خلايا CD4 + T في العقدة الليمفاوية explanted.

تشريح و 2 الفوتون التصوير من العقد الليمفاوية الطرفية في الفئران

نحن تصف طريقة لتصور مرارا الفئران الخلايا الدبقية الصغيرة وتعميم...

تقنية نافذة رقيقة الجمجمة لالمزمنة ثنائي الفوتون في الجسم الحي التصوير من الخلايا الدبقية الصغيرة في الفئران نماذج من Neuroinflammation

لقد قمنا بتطوير أدوات وبروتوكولات مخبرية حديثة للاستحواذ على صور حية داخل الجسم (intravital imaging) للغدة الزعترية. ومن شأن تقنيتنا أن تساعد في تحديد "المنافذ" (niches) داخل الغدة الزعترية حيث يحدث تطور الخلايا التائية.

Intravital تصوير الغدة الصعترية باستخدام الماوس 2 فوتون الميكروسكوب

يوفر التصوير بفاصل زمني &lt; p class = 'jove_content'&gt; في الحي معلومات قيمة عن إعادة التنظيم الهيكلي في الدماغ السليم. هنا ، نقدم مستحضر جمجمة رقيق يسمح بالتصوير عبر الجمجمة للهياكل المشبكية المصنفة بالفلورسنت في قشرة الفأر الحي عن طريق الفحص المجهري ثنائي الفوتون.

ثنائي الفوتون<em&gt; في الجسم الحي</em&gt; التصوير من العمود الفقري شجيري في اللحاء باستخدام الماوس الجمجمة ضعفت إعداد

وهدف البروتوكول لإظهار تتبع في الوقت الحقيقي إينترافيتال طولية من الثيموسيه بالليزر الفحص المجهري في الغدة الصعترية يزرع في الغرفة الأمامية للعين الماوس. شفافية القرنية والأوعية الدموية للفساد يسمح باستمرار تسجيل السلف خلية التجنيد وخروج تي خلية ناضجة.

في الوقت الحقيقي في فيفو تتبع الثيموسيه في الغرفة الأمامية للعين بالليزر الفحص المجهري

في هذه الدراسة، نقدم بروتوكولا لأداء اثنين-فوتون إينترافيتال التصوير وخلية تحليل التفاعل في الغشاء المخاطي الرغامى مورين بعد الإصابة بفيروس الإنفلونزا. سوف يكون هذا البروتوكول ذات الصلة للباحثين دراسة ديناميات الخلايا المناعية أثناء التهابات الجهاز التنفسي.

تصوير تفاعل الخلية في الغشاء المخاطي الرغامى أثناء عدوى فيروس الإنفلونزا باستخدام الفحص المجهري إينترافيتال اثنين-فوتون

تحدث التغيرات المورفولوجية في الخلايا الليفية المتجاوبة المناعية بعد التنشيط وتعزيز التعديلات في التوظيف الخلوي. استخدام التصوير بفوتونين بالاقتران مع بروتين خاص بالفيبلاف 1 (FSP1) من الفوتونات وراثياً؛ tdTomato floxed-stop-floxed (TB/TB) خط الماوس والأخضر الفلورسنت الموسومة lipopolysaccharide-FITC، يمكننا أن نوضح استيعاب محددة للغاية من lipopolysaccharide في الخلايا الليفية الجلدية والتغيرات المورفولوجية في الجسم الحي.

في فيفو اثنين من اللون 2-الفوتون التصوير من الخلايا المراسل الموسومة وراثيا في الجلد

يصف هذا البروتوكول إجراء الأشعة التداخلية الذي تم إنشاؤه للحقن داخل الغدة الصعترية في الفئران لتجنب خطر الجراحة المفتوحة وتحسين دقة الحقن الأعمى عن طريق الجلد.

تقنية طفيفة التوغل ودقيقة وفعالة للحقن داخل الزعتر في الفئران

هنا ، نقدم بروتوكولا لتصوير الرئة اليسرى للفأر المزروع باستخدام المجهر ثنائي الفوتون. يمثل هذا أداة قيمة لدراسة الديناميات الخلوية والتفاعلات في الوقت الفعلي بعد زرع رئة الفئران.

الفحص المجهري ثنائي الفوتون داخل الجسم لرئة الفأر المزروعة

يحتوي هذا البروتوكول على وصف شامل لنهج خطوة بخطوة لنموذج فأر نافذة جمجمة مزمنة وميكروفوعية وعائية محسن للتصوير بمجهر ثنائي الفوتون في الجسم الحي باستخدام مجهر بوليسترين فلوري.

نموذج الفأر للانسداد الميكروأوعية الدموية للمجهر ثنائي الفوتون في الجسم الحي باستخدام مجهر البوليسترين الفلورية

تقدم هذه الدراسة نهج تصوير فوتوني في الجسم الحي ، لرؤية هياكل نهايات محاور المستقبل الميكانيكية منخفضة العتبة (LTMR) في جلد مخلب الفئران الأمامي. باستخدام تصوير متكرر وعالي الدقة للمحاور العصبية الفردية، توفر هذه الطريقة منصة جديدة لدراسة بنية ووظيفة الدائرة الحسية الجلدية أثناء التطور وفي البالغين.

تصوير ثنائي الفوتون داخل الحيوية لشكل المحاور الحسية باللمس في جلد الفأر

تعلم تصوير الغدة الصعترية في الموقع باستخدام الميكروسكوب ثنائي الفوتون لدراسة هجرة الخلايا في الفئران. يُمكّن هذا البروتوكول الباحثين من مراقبة ديناميكيات الخلايا التائية حية.

التصوير في الموقع من الغدة الصعترية ماوس باستخدام الميكروسكوب 2 فوتون

استكشف المزيد من الفيديوهات