استخراج وكشف الجيوسمين و 2-ميثيل الأيزوبورنيول في الماء والأسماك باستخدام مجسات الاستخراج الامتصاصية عالية السعة و GC-MS

[الراوي] في هذا الفيديو سوف نوضح عملية استخراج واكتشاف الجيوسمين و 2-ميثيل الأيزوبورنيول من عينات المياه والأسماك باستخدام مجسات الاستخراج الامتصاصية عالية السعة وقياس الطيف الكتلي للغاز ، أو GC-MS. الجيوسمين و 2-ميثيل إيزوبورنيول هما مركبات عضوية متطايرة من أصل ميكروبي تحدث في الجداول أو الأحواض أو الآبار أو حتى أنظمة الاستزراع المائي المعاد تدويرها. يمكن لهذه المركبات الرائحة أن تضفي روائح ونكهات كريهة على الماء والأسماك المزروعة فيها حتى بتركيزات منخفضة للغاية. هنا نرى عالما يجمع المياه من نظام تربية الأحياء المائية المعاد تدويره. يتم جمع عينات مياه Geosmin و 2-methylisoborneol في قوارير زجاجية بنية مصنفة للمركبات العضوية المتطايرة مع عدم ترك هواء في القارورة. للقيام بذلك ، قم بغمر القارورة وتغطيتها تحت الماء حتى لا تبقى فقاعات هواء. نبدأ بإعداد معاييرنا ومعاييرنا الداخلية. أولا ، قم بإعداد محلول مخزون يحمل علامة C1 عن طريق إضافة 10 ميكرولتر من محلول الجيوسمين و 2-ميثيل إيزوبورنيول بتركيز 100 ميكروغرام لكل لتر إلى قارورة حجمية سعة 100 ملليلتر. املأ القارورة إلى علامة الحجم بالميثانول من الدرجة LC / MS. ينتج عن هذا محلول يحتوي على كل مادة تحليلية بتركيز 10 ميكروغرام لكل لتر. بعد ذلك ، يتم إعداد معايير المعايرة عن طريق إضافة أحجام محددة من محلول مخزون C1 إلى القوارير الحجمية سعة 100 مليلتر وتعبئتها بالماء منزوع الأيونات. من المهم إعداد معايير معايرة جديدة يوميا ، لأن هذه الحلول قابلة للتلف للغاية. بالنسبة للمعايير الداخلية ، قم بإنشاء حل المخزون I1 عن طريق إضافة 10 ميكرولتر من 2-isopropyl-3-methoxypyrazine ، المعروف أيضا باسم IPMP ، إلى قارورة حجمية سعة لتر واحد مملوءة بالميثانول من الدرجة LC / MS ، مما يجعل محلول مخزون 10 ملليغرام لكل لتر. ثم قم بإعداد محلول ثان I2 عن طريق إضافة مائة ميكرولتر من محلول مخزون I1 إلى قارورة حجمية مائة مل وتعبئتها بالماء منزوع الأيونات لتحقيق تركيز 10 ميكروغرام لكل لتر. ابدأ بوضع عينة واحدة من قارورة الماء سعة 20 مل في صينية العينات. قم بوزن 2.5 جرام من كلوريد الصوديوم وأضفه إلى كل قارورة عينة. تعمل إضافة الملح على تعزيز نقل الجيوسمين و MIB من الماء إلى الفراغ. أضف خمسة ملليلتر من عينة الماء إلى كل قارورة وقم برفعها ب 50 ميكرولترا من المحلول القياسي الداخلي I2. قم بتغطية كل قارورة وإغلاقها مباشرة بعد التحضير لتقليل فقد التحليل اللاهي. الخطوة التالية هي استخراج التحليل التحليلي. ضع درج العينة في حامل درج أخذ العينات الأوتوماتيكي وقم بإعداد طريقة الجهاز باستخدام الإعدادات الرئيسية التالية: وقت تحريك أخذ العينات المسبقة عند 10 دقائق. معلمات أخذ العينات: احتضان عند 65 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة بسرعة تحريض تبلغ 400 دورة في الدقيقة. تأكد من تمكين خيار مسبار الغسيل HiSorb لمنع التلوث المتبادل بين العينات. امتصاص المسبار: اضبط لمدة 15 دقيقة عند 270 درجة مئوية. إعدادات المراكب: درجة حرارة حمل المصيدة 25 درجة مئوية ومعدل تدفق مقسم يبلغ ثمانية ملليلتر في الدقيقة. بمجرد وضع هذه الإعدادات في مكانها الصحيح ، ابدأ تشغيل جهاز أخذ العينات التلقائي جنبا إلى جنب مع طريقة GC-MS لتحليل عينات المياه. لتحليل أنسجة الأسماك ، ضع قارورة واحدة سعة 20 مل لكل عينة سمكة في الصينية. قم بتجانس أنسجة السمك باستخدام محضر الطعام وقم بوزن جرام واحد من الأنسجة المتجانسة في كل قارورة. أضف خمسة ملليلتر من محلول كلوريد الصوديوم المشبع وقم برفع كل عينة ب 100 ميكرولتر من المحلول القياسي الداخلي I2. قم بتغطية وإغلاق كل قارورة على الفور. طريقة استخراج عينات الأسماك مماثلة لتلك الخاصة بالمياه ولكن مع وجود اختلافات رئيسية بسبب الطبيعة الغنية بالدهون لأنسجة السمك. تشمل هذه الاختلافات وقت التحريض قبل أخذ العينات: اضبط لمدة 20 دقيقة. درجة حرارة حضانة العينات: 80 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة مع سرعة تحريك 400 دورة في الدقيقة. تأكد من تمكين وظيفة Wash HiSorb probe. بمجرد اكتمال هذه الخطوات ، قم بتشغيل جهاز أخذ العينات الآلي جنبا إلى جنب مع طريقة GC-MS لتحليل عينات الأسماك ، وتنطبق نفس معلمات GC-MS على كل من طرق المياه والأنسجة السمكية. تم تجهيز GC بخمسة عمود MS 30 مترا × 0.25 ملم × 0.25 ميكرون. يستخدم الهيليوم فائق النقاء كغاز ناقل ، بمعدل تدفق ملليلتر في الدقيقة. يبدأ برنامج الفرن بدرجة حرارة أولية تبلغ 60 درجة مئوية لمدة ثلاث دقائق ، تليها درجة حرارة منحدرة من 10 درجات مئوية في الدقيقة إلى 100 درجة مئوية ، ثم 20 درجة مئوية في الدقيقة إلى 190 درجة مئوية ، و 30 درجة مئوية في الدقيقة إلى 280 درجة مئوية مع وقت انتظار نهائي مدته دقيقتان. إجمالي وقت التشغيل حوالي 16.5 دقيقة. بالنسبة لخط النقل بين GC و MS ، اضبط درجة الحرارة على 280 درجة مئوية مع مصدر الأيونات عند 250 درجة مئوية والرباعي عند 200 درجة مئوية. في MS لوضع المسح الضوئي ، استخدم نطاقا من 50 إلى 350 نسبة كتلة إلى شحن. لمراقبة الأيونات المحددة ، أو SIM ، استخدم الأيونات التالية للقياس الكمي والتأكيد: IPMP ، 152 و 137 نسبة الكتلة إلى الشحن. MIB ، 95 إلى 107 نسبة الكتلة إلى الشحن. و geosmin ، 112 و 55 نسبة الكتلة إلى الشحن. أخيرا ، قم دائما بمراجعة تحديدات الذروة يدويا في برنامج الكروماتوغرافيا الخاص بك لتجنب الأخطاء. يحدد هذا البروتوكول خطوات الكشف عن الجيوسمين و 2-ميثيل إيزوبورنيول في عينات المياه والأسماك باستخدام مجسات الاستخراج الامتصاصية عالية السعة و GC-MS. باتباع هذه التعليمات بعناية ، يمكن للباحثين ضمان نتائج دقيقة وموثوقة في تحليل وجود هذه المركبات. يوضح الشكل الأول تأثير درجة حرارة امتصاص المسبار على الترحيل. تم تحليل معيار مختبري يحتوي على الجيوسمين و 2-ميثيل إيزوبورنيول عند 20 نانوغرام لكل لتر في ثلاث درجات حرارة مختلفة لامتصاص المسبار. توفر اللوحة A متوسط مناطق الذروة للجيوسمين وقاعدة معلومات الإدارة (MIB). تم امتصاص كل مسبار بعد ذلك مرتين أخريين في نفس درجة الحرارة الأولية لتقييم الترحيل. وترد نتائج الجيوسمين وقاعدة المعلومات الإدارية (MIB) في اللوحتين B وC على التوالي. يتم التعبير عن الترحيل كمنطقة الذروة كنسبة مئوية من منطقة الذروة الأولية. تمثل أشرطة الخطأ الانحراف المعياري عبر ثلاث نسخ مكررة. تشير النتائج إلى أن ارتفاع درجة حرارة الامتصاص يقلل من الترحيل دون المساس بالحساسية. يمثل الشكل الثاني مقارنة بين استعادة البيانات المصححة مقابل غير المصححة للمعايير التحليلية عند 15 و 40 نانوغراما لكل لتر باستخدام مجسات PDMS للاستخراج. تم تصحيح العينات باستخدام 2-isopropyl-3-methoxypyrazine ، أو IPMP ، كمعيار داخلي. بدون تصحيح ، كان التعافي أقل بكثير ، مع تصحيحات بنسبة 60٪ تقريبا من المبالغ المرتفعة المعروفة. بمجرد التصحيح ، كان التعافي قريبا من 100٪ ، مما يدل على أهمية استخدام المعايير الداخلية للقياس الكمي بدقة. يقارن الشكل الثالث بيانات الاسترداد للجيوسمين على اليسار و 2-ميثيل إيزوبورنيول على اليمين عند 15 نانوغرام لكل لتر باستخدام نوعين من المجسات: مجسات PDMS فقط ومجسات ثلاثية الطور ، والتي تشمل PDMS و divinylbenzene ونطاق واسع من الكربون. يظهر كلا النوعين من المسبار أداء جيدا ، على الرغم من أن مجسات PDMS فقط كانت لديها معدلات استرداد أفضل قليلا. بالنظر إلى هذه النتيجة وتوفير التكاليف ، تم إجراء التحليل المستقبلي باستخدام تحقيقات PDMS فقط. يوضح الشكل الرابع الانحدار الخطي لمنحنيات المعايرة للجيوسمين وقاعدة معلومات الإدارة (MIB). يمثل النطاق الصلب geosmin بقيمة R-squared 0.9999 ، ويمثل الخط المتقطع MIB ، أيضا بقيمة R تربيعية تبلغ 0.9999. يظهر كلا المنحنيين خطية ممتازة مع الحد الأدنى من الخطأ ، مما يتحقق من صحة الدقة الكمية للطريقة على نطاق التركيز المختبر. يوضح الشكل الخامس تركيزات الجيوسمين و 2-ميثيل إيزوبورنيول في عينات المياه المأخوذة من سبعة أنظمة مختلفة للاستزراع المائي. توضح اللوحة A تركيزات الجيوسمين ، وتوضح اللوحة B تركيزات MIB. كان لكل نظام ثلاث نسخ مكررة على الأقل ، وفي معظم الحالات ، كانت تركيزات هذه المركبات أعلى من حدود الكشف عن الطريقة. تجاوز أحد الأنظمة ، المسمى النظام الأول ، عتبة الرائحة البشرية للجيوسمين ، مما يسلط الضوء على مشكلة محتملة تتعلق بجودة المياه في هذا النظام. يقدم الشكل السادس بيانات من عينتين من الأسماك ، المسماة F1 و F2 ، والتي تم رفعها بالجيوسمين و 2-ميثيل إيزوبورنيول. تم تحليل كلا المركبين في ثلاث نسخ لتحديد الانتعاش والدقة. يتم رسم تركيزات الجيوسمين و MIB وعينات الأسماك المسننة ، مما يدل على قدرة الطريقة على الكشف بدقة عن هذه المركبات حتى في أنسجة الأسماك الغنية بالدهون. توفر الطرق الموضحة اليوم إطارا قويا للكشف الحساس عن الجيوسمين و 2-ميثيل إيزوبورنيول. من خلال دمج مجسات الاستخراج الامتصاصية عالية السعة والتحليل الدقيق ل GC-MS ، أظهرنا تقنية تعزز بشكل كبير قدراتنا على الكشف. لا يؤدي هذا التقدم المنهجي إلى تحسين الإنتاجية فحسب ، بل يقلل أيضا من مخاطر الخطأ البشري ويزيد من قابلية تكرار النتائج. ومع استمرارنا في تحسين هذه التقنيات، فإنها ستصبح بلا شك أدوات لا غنى عنها في مجال الرصد البيئي وتقييم جودة الأغذية.