العزل القائم على قياس التدفق الخلوي والتقييم العلاجي للخلايا الليمفاوية المتسللة للورم في نموذج فأر لسرطان البنكرياس
يناير 17, 2025
نصف طريقة لاستخدام الخلايا الليمفاوية المتسللة للورم (TILs) من الفئران من خلال قياس التدفق الخلوي لنقل الخلايا بالتبني. يهدف هذا البروتوكول إلى التحقق من السمية الخلوية المحددة ل TILs ضد الأورام في نموذج فأر سرطان البنكرياس المتزاوي ، مما يوفر رؤى حول تطوير علاجات الخلايا بالتبني لسرطان البنكرياس.
نحن نركز على تطوير طريقة لعزل الخلايا الليمفاوية المتسللة للورم ، TILs ، ونقلها بالتبني في نموذج سرطان البنكرياس. نحن نحاول الإجابة عما إذا كانت المجموعات الفرعية من TILs يمكن أن تستهدف وتقتل أورام البنكرياس بشكل فعال في الجسم الحي وكيف يمكن تحسين الخلايا التائية للتجارب السريرية المستقبلية. التطورات الحديثة في العلاج بالخلايا بالتبني ، بما في ذلك تعزيز تقنيات عزل TIL والتعبير عنها ، وتعديل TILs بلطف لتحسين استهدافها والجمع بين علاج TIL والعلاجات المناعية الأخرى مثل مثبطات نقاط التفتيش أو العلاجات المستهدفة لتعزيز الفعالية المضادة للأورام.
لقد أنشأنا طريقة قوية لعزل وتوسيع TILs التفاعلية للورم من نموذج فأر سرطان البنكرياس. لقد أظهرنا فعالية معززة مضادة للورم للخلايا التائية التفاعلية للورم المنقولة بالتبني. يقدم بروتوكولنا نهجا أكثر استهدافا للعلاج بالخلايا بالتبني من خلال تمكين عزل واختيار TILs الخاصة بالورم مقارنة بالطرق الأخرى الأقل تحديدا.
كما أنه يستخدم عن طريق التصوير الحيوي لمراقبة الورم غير الغازية. ستعمل النتائج التي توصلنا إليها على تعزيز المجال من خلال توفير نموذج ما قبل السريري الموحد لتقييم فعالية علاج TIL وتحسين معايير العلاج للمجموعات الفرعية للخلايا التائية لسرطان البنكرياس. لتحضير معلق خلية KPC-Luciferase لإحداث ورم بنكرياس تقويم العظام في الفئران ، قم بتربسين خط خلايا KPC-Luciferase لمدة دقيقة واحدة عند 37 درجة مئوية.
بعد التربسين ، أضف PBS ، وانقل الخلايا ، ثم قم بالطرد المركزي لتعليق الخلية. عد الخلايا وأعد تعليقها بتركيز 1 في 10 إلى قوة 6 خلايا لكل مليلتر في PBS تحتوي على 30٪ مصفوفة غشاء القاعد. ضع الماوس المخدر على منصة التشغيل.
بعد إجراء شق في البطن الأيسر من 0.5 إلى 1 سم ، أمسك الطحال باستخدام الملقط وكشف البنكرياس. بعد تحضير خلايا KPC-Luciferase ومزيج مصفوفة الغشاء القاعدي ، قم بحقن 50 ميكرولترا من معلق الخلية الذي يحتوي على 50،000 خلية في البنكرياس باستخدام إبرة قياس 29. أعد البنكرياس إلى تجويف البطن.
خياطة الصفاق والجلد بالتتابع. اسمح للماوس بالتعافي على وسادة دافئة حتى يستيقظ تماما. بعد سبعة أيام ، قم بحقن الفأر داخل الصفاق ب 60 ميكرولتر من محلول ملح البوتاسيوم D-Luciferin للتصوير الحي.
بعد التخدير ، ضع الفأر في نظام التصوير في الجسم الحي للكشف عن التلألؤ البيولوجي. بعد التصوير ، قم بإزالة الماوس من النظام واتركه يتعافى بشكل طبيعي من التخدير. للبدء ، ضع الماوس القتل الرحيم للمتبرع على منصة تشغيل.
تعقيم الجسم كله بنسبة 75٪ من الإيثانول. في غطاء معقم ، استخدم المقص والملقط لفتح تجويف البطن. قم بإزالة الورم ووضعه في PBS على الجليد.
قم بقياس حجم الورم بعيار Vernier. بعد ذلك ، احسب حجم الورم باستخدام الصيغة التي تظهر على الشاشة. بعد تحضير محلول الهضم 1X باستخدام الكولاجيناز و Dispase II و DNAse I في RPMI 1640 ، أضف ملليلترا إلى ملليلترين من المحلول لكل بئر في طبق مكون من 12 بئرا.
افرم الأورام إلى قطع صغيرة باستخدام المقص. انقل قطع الورم إلى كل بئر من صفيحة مكونة من 12 بئرا وهضمها عند 37 درجة مئوية أثناء الرج عند 70 دورة في الدقيقة لمدة 30 دقيقة. لإنهاء عملية الهضم ، أضف ملليلترا إلى ملليلترين من مصل الأبقار الجنينية بنسبة 10٪ وانقل تعليق الخلية إلى أنبوب تجميع.
اغسل آبار الصفيحة المكونة من 12 بئرا مرتين باستخدام PBS لجمع أي خلايا متبقية. قم بتصفية معلق الخلية من خلال مصفاة خلية 70 ميكرومتر ، وقم بفرم وسحق شظايا الأنسجة لتحرير الخلايا المفردة باستخدام الطرف المسطح لمكبس المحقنة. الطرد المركزي المرشح عند 400 جم لمدة خمس دقائق عند أربع درجات مئوية ، وأعد تعليق الحبيبات في 5٪ ألبومين مصل البقر لتلوين قياس التدفق الخلوي.
للبدء ، ضع الخلايا المعزولة من الفأر الحامل للورم جنبا إلى جنب مع خلايا الطحال أو الدم المحيطي أحادي النواة من الفأر غير الحامل للورم على منصة عمل. تلطخ الخلايا مع حاصرات FC والأجسام المضادة للتدفق عند تخفيف من 1 إلى 100. احتضان الأنابيب على الجليد في الظلام لمدة 30 دقيقة.
بعد الحضانة ، اغسل الخلايا مرتين في PBS عن طريق الطرد المركزي قبل تعليقها في ألبومين مصل الأبقار بنسبة 1٪ في PBS. على مقياس التدفق الخلوي ، لفرز خلايا CD45 + CD3 + ، قم بتوصيل الخلايا الحية بناء على FSC-A و SSC-A لإنشاء بوابة P1. بعد ذلك ، قم بتوصيل الخلايا المفردة من P1 بناء على FSC-A و FSC-H لإنشاء البوابة P2. قم بفرز خلايا CD45 + CD3 + من P2 باستخدام بوابات CD45 و CD3. اجمع الخلايا التي تم فرزها في أنابيب التجميع.
قامت أجهزة الطرد المركزي بفرز خلايا CD45 + CD3 + عند 400 جم لمدة خمس دقائق عند أربع درجات مئوية. أعد تعليق الخلايا في مصل الفأر بتركيز 1 في 10 إلى قوة 6 خلايا لكل مليلتر ، ووضعها على الجليد. ضع الفأر المتلقي الناجم عن الورم على منصة تشغيل.
باستخدام حقنة الأنسولين قياس 29 بوصة 1/2 بوصة ، قم بحقن الخلايا المناعية التي تم فرزها داخل الصفاق بعد ذلك، يتم تطبيق إنترلوكين-2 داخل الصفاق لمدة ثلاثة أيام متتالية.
اعرض النص الكامل واحصل على الوصول إلى آلاف الفيديوهات العلمية
المراجعة
تقترح هذه الدراسة طريقة لعزل ونقل الخلايا اللمفاوية المتغلغلة في الورم (TILs) في نموذج لسرطان البنكرياس. تهدف الدراسة لتقييم فعالية مجموعات TIL في استهداف وإزالة الأورام البنكرياسية في الجسم الحي.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلوم
- علم المناعة
- علم الأورام
- العلاج الخلوي
الخلفية
- الخلايا اللمفاوية المتغلغلة في الورم ضرورية للاستجابة المناعية ضد الأورام.
- العلاج الخلوي المعتمد أظهر وعدًا في علاج السرطان.
- يمثل سرطان البنكرياس تحديات فريدة للعلاج المناعي.
- تعزيز عزل الخلايا اللمفاوية المتغلغلة في الورم وتوجيهها ضروري للعلاجات الفعالة.
هدف الدراسة
- لعزل وتوسيع الخلايا اللمفاوية المتغلغلة في الورم التفاعلية لسرطان البنكرياس من نموذج فأر لسرطان البنكرياس.
- لتقييم السيتوטוكسية للخلايا اللمفاوية المتغلغلة في الورم ضد الأورام البنكرياسية.
- لتحسين علاجات الخلايا التائية للتطبيقات السريرية المستقبلية.
الطرق المستخدمة
- قياس التدفق الخلوي لعزل الخلايا اللمفاوية المتغلغلة في الورم.
- تقنيات نقل الخلايا المعتمد.
- اختبارات استهداف الورم في الجسم الحي.
- علاجات مركبة مع مثبطات نقاط التفتيش.
النتائج الرئيسية
- أظهر فعالية مضادة للورم محسنة للخلايا اللمفاوية المتغلغلة في الورم التفاعلية مع الورم.
- أقام طريقة قوية لعزل الخلايا اللمفاوية المتغلغلة في الورم وتوسيعها.
- أظهر إمكانيات الجمع بين علاج الخلايا اللمفاوية المتغلغلة في الورم والعلاجات المناعية الأخرى.
- قدم رؤى حول تحسين الخلايا اللمفاوية المتغلغلة في الورم للتجارب السريرية.
الاستنتاجات
- تقدم الدراسة نهجًا مستهدفًا للعلاج الخلوي المعتمد.
- تظهر الخلايا اللمفاوية المتغلغلة في الورم المعزولة وعدًا في استهداف الأورام البنكرياسية بشكل فعال.
- يجب أن تركز الأبحاث المستقبلية على التطبيقات السريرية للخلايا اللمفاوية المتغلغلة في الورم المحسنة.
الأسئلة المتداولة
Executive Industry Relevance
Flow cytometry-based isolation and adoptive transfer of tumor-infiltrating lymphocytes (TILs) in a pancreatic cancer mouse model addresses a critical gap in preclinical immunotherapy development. This workflow enables precise evaluation of TIL subset efficacy, supporting predictive confidence in target validation and mechanistic de-risking for cell therapy pipelines. The approach provides a standardized platform for optimizing cell processing and combination regimens, directly informing translational and portfolio advancement decisions.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of TIL subset function and tumor specificity in vivo.
- Supports mechanistic de-risking by isolating and expanding tumor-reactive lymphocytes.
- Facilitates predictive confidence in immunotherapy target selection and validation.
Screening & Assay Development
- Provides validated immune cell populations for downstream cytotoxicity and efficacy assays.
- Standardizes TIL isolation and expansion for reproducible assay development.
- Enables quantitative assessment of tumor response using bioluminescent imaging.
Translational & Preclinical Research
- Aligns preclinical models with disease-relevant immune responses in pancreatic cancer.
- Supports optimization of cell processing parameters and combination immunotherapy regimens.
- Enables longitudinal monitoring of therapeutic efficacy in vivo.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates from early discovery through preclinical validation, bridging target validation, assay development, and translational research for adoptive cell therapies.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of TIL-mediated tumor cytotoxicity and immune pathway clarification.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative outputs for immune cell efficacy assessment.
- Analytics: Provides bioluminescent imaging and flow cytometry data for comparative analysis of treatment conditions.
- Translational Research: Ensures continuity from discovery to preclinical evaluation of cell therapy strategies.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for evaluating and optimizing adoptive immunotherapy workflows.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in immunotherapy development.
- Operational Value: Standardizes TIL isolation, expansion, and monitoring for scalable preclinical studies.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions and enhances capital efficiency by de-risking cell therapy candidates.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization and advancement of immunotherapy assets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in flow cytometry, immune cell handling, and in vivo imaging.
- Demands access to specialized instrumentation for cell sorting and bioluminescent monitoring.
- Necessitates cross-team standardization of cell processing and assay protocols.
- Adaptation may be needed for different tumor models or immune cell subsets.
- Throughput and scalability are limited by animal model and cell expansion logistics.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:00
Introduction
2:17
Inducing Orthotopic Pancreatic Tumors in Mice Using KPC-Luciferase Cells
4:04
Orthotopic Pancreatic Tumor Harvesting and Single-Cell Preparation for Flow Cytometry
5:53
Flow Cytometry-Guided Tumor Cell Isolation, Adoptive Transfer, and Tumor Monitoring in Pancreatic Cancer Recipient Mice
