نظام الفيزيولوجيا الدقيقة للقلب لدراسة انتشار Ca²⁺ عن طريق التحفيز البصري غير الجيني

يهدف البحث إلى تطوير نماذج الفيزيولوجيا الدقيقة للقلب في المختبر من خلال دمج طرق التحفيز الضوئي القائمة على المواد. يركز على التغلب على القيود المفروضة على طول العمر وغزو التحفيز ، وتوفير أدوات موثوقة لدراسة فسيولوجيا القلب ، وتحسين عمليات فحص الأدوية ، وتعزيز التطبيقات في نمذجة الأمراض. التطورات الحديثة في التحفيز الحيوي الاستفادة ، مثل التحكم الخلوي الدقيق غير الغازي.

يتيح علم الوراثة البصرية التعديل الجيني لتنظيم النشاط الخلوي ، بينما تقدم محولات الطاقة الضوئية القائمة على المواد الناشئة بدائل غير جينية. يوفر هذا الابتكار طفرة كبيرة في دراسة وتعديل الخلايا العصبية وخلايا عضلة القلب وخلايا العضلات الهيكلية عبر تطبيقات متنوعة. تشمل التحديات التجريبية الحالية تحقيق توصيل متسق للضوء إلى الأنسجة العميقة ، وتحسين التوافق الحيوي واستقرار محولات الطاقة الضوئية ، وتحسين دقة تقنيات التحفيز القائمة على الضوء.

بالإضافة إلى ذلك ، يظل دمج هذه الأساليب مع الأنظمة البيولوجية المعقدة مع الحفاظ على قابلية الخلايا ووظائفها عقبة رئيسية. يعالج هذا البروتوكول الفجوة البحثية المتمثلة في الحاجة إلى تقنيات تحفيز دقيقة غير جراحية في نماذج الفيزيولوجيا الدقيقة للقلب. باستخدام محولات الطاقة الضوئية القائمة على المواد ، مثل Ziapin2 ، يتغلب هذا النهج على قيود التحفيز الكهربائي التقليدي وعلم البصريات الوراثي ، مما يوفر محيطا زمنيا ومكانيا محسنا مع الحفاظ على صلاحية الأنسجة ووظيفتها.

ستعمل النتائج التي توصلت إليها على تعزيز البحث من خلال إدخال تقنية تحفيز الضوء غير الغازية القائمة على المواد والتي توفر دقة أكبر وتحكما أكبر في النشاط الخلوي في أنسجة القلب. يلغي هذا النهج الحاجة إلى التعديلات الجينية ، ويوفر أداة متعددة الاستخدامات لنمذجة وظائف القلب ، ودراسة آليات المرض ، وتطوير استراتيجيات علاجية أكثر فعالية. للبدء ، قم بلصق طبقتين من شريط المختبر ، واحدة بيضاء والأخرى زرقاء ، على لوح أكريليك شفاف بسمك واحد ومليمتر واحد ومقاوم للخدش والأشعة فوق البنفسجية.

قم بقص نمط الرقاقة على الشريط وفقا للتصميم المقصود ، ثم باستخدام حفارة ليزر ثاني أكسيد الكربون ، قم بقص لوح الأكريليك إلى دوائر. قم بإزالة طبقتين من الشريط داخل الخط الأعمق باستخدام الملقط. انقع الرقائق في مبيض نقي لمدة 30 دقيقة إلى ساعة واحدة لإزالة الخطوط السميكة والبقع الداكنة من القطع ، وترك خط حاد ، واشطف الرقائق في دورق بالماء منزوع الأيونات الجاري طوال الليل أو لمدة ثلاث ساعات على الأقل.

قم بتقطيع الرقائق لمدة 10 دقائق في طوابع polydimethylsiloxane أو PDMS ، مع ميزات أخدود الخط لمدة 30 دقيقة في 70٪ من الإيثانول النظيف. انقل الرقائق والطوابع إلى منطقة نظيفة أسفل غطاء المحرك واتركها تجف تحت تدفق الهواء لمدة ساعة إلى ساعتين تقريبا. بعد ذلك ، قم بصوتنة الجيلاتين الطازج لمدة 15 دقيقة ، ثم أعده إلى حمام مائي 65 درجة مئوية حتى يصبح جاهزا للاستخدام.

ضع أنبوب ترانسجلوتاميناز الميكروبي ، أو أنبوب MTG ، في مجفف مع فك الغطاء قليلا وقم بتشغيل المكنسة الكهربائية ببطء لإزالة الفقاعات. بعد التفريغ ، أعد أنبوب MTG إلى حمام مائي 37 درجة مئوية. بعد ذلك ، قم بتغطية ورقة شبكية ب Parafilm نظيف وضع الرقائق على الشبكة.

احتفظ بختم PDMS في مكان قريب للاستخدام. أضف خمسة ملليلتر من MTG إلى خمسة ملليلتر من محلول الجيلاتين ، مع سحب العينة بعناية لتجنب الفقاعات. الآن ، قم بنقل ما يقرب من 0.5 مل من خليط الجيلاتين بسرعة على كل شريحة ، مما يضمن أن الخليط يغطي منطقة الرقائق.

ضع ختم PDMS المزخرف بالخط في الأعلى وقم بتطبيق وزن 200 جرام للتأكد من أن الجيلاتين منقوش بالتوازي مع المحور الطولي للنسجة. بمجرد تشكيل جميع الرقائق ، قم بتغطيتها بوعاء زجاجي لتجنب الاضطرابات البيئية والسماح لها بالارتباط بين عشية وضحاها. انقل الشريحة وختم PDMS المحصور إلى طبق P150 جديد مليء ب PBS لترطيب الجيلاتين لمدة 30 دقيقة إلى ساعة واحدة لتسهيل فصل ختم PDMS عن الشريحة.

بعد إزالة أي جيلاتين زائد غير مقالب حول الرقاقة ، انقل الشريحة النظيفة إلى طبق P150 جديد مليء ب PBS. قم بتخزين طوابع PDMS بنسبة 70٪ من الإيثانول. لتعقيم الرقائق ، انقعها في الإيثانول لمدة 10 دقائق تحت الغطاء.

انقل الرقائق إلى PBS ، وانقعها لمدة 10 دقائق ، متبوعة بغسل PBS ثلاث مرات. بالنسبة لمحاليل الطلاء ، امزج 20 ميكروغراما لكل مليلتر من الفبرونيكتين مع تخفيف واحد إلى 100 من Geltrex في وسائط الزراعة بدون مكمل. قم بتغطية الرقائق بهذا المحلول لمدة ساعتين في حاضنة عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون.

قم بإذابة وبذور خلايا عضلة القلب المشتقة من الخلايا الجذعية متعددة القدرات التي يسببها الإنسان في وسط RPMI الذي يحتوي على 10 ميكرومولار Y-27632. استبدل الوسيط ب RPMI الخالي من Y-27632 بعد 24 ساعة. بعد ثلاثة أيام من بذر الخلايا ، استخدم الملقط لإزالة الشريط الأبيض بعناية من الرقائق.

إعداد جهاز رسم الخرائط البصرية المكون من مجهر عدسات ترادفية معدل مزود بكاميرا عالية السرعة ومصباح زئبق 200 ملي واط كمصدر لضوء الإثارة. ضع مرآة ثنائية اللون أمام كاميرا تصوير الكالسيوم المخصصة. للسرعة البصرية ، قم بتطبيق تحفيز النقطة البصرية في أحد طرفي الأنسجة باستخدام مصدر ضوء LED لتحفيز Ziapin2 ، محول الطاقة الضوئي.

قم بتسريع الأنسجة بتردد 0.5 ، أو هرتز واحد ، عبر ألياف ضوئية منظمة مؤقتا موضوعة على بعد ملليمتر واحد من الأنسجة. احتضان العينة باثنين من ميكرومولار X-Rhod-1 المضافين إلى وسط الاستزراع لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية. بعد غسل الرقائق بوسط استزراع طازج ، انقلها إلى وسط RPMI 1640 الخالي من الفينول ، مع استكمال B-27 مطروحا منه الأنسولين و HEPES.

ضع رقائق المناديل في طبق يتم التحكم في درجة حرارته على درجة الحرارة الفسيولوجية وابدأ التسجيل بمعدل إطارات يبلغ 2.5 إطار في الثانية. تم تصور انتشار موجات الكالسيوم بنجاح ، بدقة مكانية وزمانية واضحة أثناء التحفيز الضوئي إما بترددات 0.5 أو تردد هرتز واحد ، مع سرعات توصيل محسوبة بحوالي 4.5 سم في الثانية ، بما يتفق مع القيم الفسيولوجية. كانت معلمات الكالسيوم العابرة ، بما في ذلك السعة ، ووقت الارتفاع ، والحد الأقصى للاضمحلال ، والمنحدر ، ووقت الاضمحلال ، متشابهة كميا بين التحفيز الضوئي والتحفيز الكهربائي ، مما يؤكد الاستجابات الوظيفية المماثلة.