التصوير المناعي متعدد الإرسال القائم على الباركود الشريطي للحمض النووي لتحليل عينات FFPE من الورم الميلانيني الفئراني المعاد برمجته وراثيا

نقدم بروتوكولا لتطوير والتحقق من صحة لوحة التألق المناعي متعدد الإرسال لدراسة أنسجة FFPE للفئران وإثبات فائدتها من خلال دراسة عينات من نموذج الورم الميلانيني المعالج بجسيمات نانوية التي تقدم الحمض النووي للبلازما ، وترميز الإشارات المناعية لإعادة برمجة البيئة المكروية للورم. كان الحقل يفتقد إلى بروتوكولات التألق المناعي متعدد الإرسال المطورة والتحقق من صحتها بدقة والمتوافقة مع أنسجة FFPE المضمنة بالبارافين المثبتة بالفورمالين في الفأر.

يحافظ تضمين البارافين الثابت بالفورمالين على مورفولوجيا الأنسجة على المدى الطويل ، ويسهل التعامل معه وتخزينه ، ويتيح إنشاء مصفوفات دقيقة للأنسجة لعرض عينات متعددة على شريحة واحدة.

سيعزز التصوير البروتيني المكاني تصور وتحليل البيئة المكروية المعقدة للورم ، مما يساعد في النهاية في التنبؤ بالاستجابات المناعية ، والتي يمكن أن تساهم في تطوير علاجات أفضل.

سنستخدم هذا البروتوكول لتمكين تحسين التنميط المكاني لنماذج أورام الفئران عبر العديد من أنواع الأورام والأعضاء المناعية المختلفة.

[راوي] للبدء ، اخبز شرائح مناديل FFPE على حرارة 60 درجة مئوية طوال الليل. في اليوم التالي ، قم بتبريد الشرائح في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق قبل البدء في إزالة البارافين وإعادة الجفاف. بعد ذلك ، احتضن الشرائح في محلول الزيلين مرتين لمدة خمس دقائق لكل منهما لإزالة البارافين ، ثم أعد ترطيب الأنسجة عن طريق تحريك الشرائح عبر الإيثانول بنسبة 100٪ مرتين لمدة خمس دقائق لكل منهما. ضع الشريحة بالتتابع في محاليل الإيثانول بنسبة 90٪ و 70٪ و 50٪ و 30٪ لمدة خمس دقائق لكل منها. اغسل الشرائح مرتين بالماء المقطر لمدة خمس دقائق لكل منها. قم بإجراء استرجاع المستضد ، ثم استخدم محلول تبييض جديد لتبييض الأنسجة مرتين لمدة 45 دقيقة قبل إجراء تلطيخ الأجسام المضادة. بعد ذلك ، قم بإجراء تلطيخ الأجسام المضادة طوال الليل عند أربع درجات مئوية باستخدام غرفة بلاستيكية. بعد التلوين ، قم بإزالة الغرفة البلاستيكية واجمع كوكتيل الأجسام المضادة المطبق مسبقا. اغسل الشرائح مرتين في مخزن تلطيخ لمدة دقيقتين لكل منهما. احتضن الشرائح في وعاء تلطيخ يحتوي على 40 مل من محلول تثبيت ما بعد التلوين لمدة 10 دقائق ، ثم اشطفها باستخدام PBS ثلاث مرات لمدة دقيقتين لكل منهما. الآن انقل الشرائح إلى الميثانول المثلج لمدة خمس دقائق ، قبل شطفها باستخدام PBS. ضع 200 ميكرولتر من محلول التثبيت النهائي على كل شريحة تحت غرفة الرطوبة. بعد حضانة لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة ، اغسل الشرائح في PBS مرة أخرى لمدة ثلاث دورات مدة كل منها دقيقتين. في حالة التصوير على الفور، امسح الشريحة حول النسيج باستخدام منديل خال من النسالة. اضغط على خلية التدفق لمدة 30 ثانية باستخدام معدات تجميع خلايا التدفق. في حالة التصوير لاحقا ، قم بتخزين الشريحة دون تطبيق خلية التدفق في المخزن المؤقت للتخزين عند أربع درجات مئوية. عندما تكون جاهزا للصورة، انقل الشرائح من مخزن التخزين المؤقت إلى PBS لمدة 10 دقائق قبل تطبيق خلية التدفق. بعد ذلك ، قم بإعداد مخازن DMSO قيد التشغيل بناء على دورات التصوير المطلوبة. قم بإعداد حل مخزون المراسل المطلوب للعدد الإجمالي لدورات التصوير. ماصة 250 ميكرولتر من محلول مخزون المراسل وخمسة ميكرولتر من كل مراسل في أنابيب طرد مركزي دقيقة باللون الأسود أو الكهرماني سعة ملليلتر واحد. انقل المحلول إلى صفيحة سوداء مكونة من 96 بئرا وأغلقها بورق لاصق. الآن ابدأ تشغيل جهاز التصوير واستخدم مدير الأجهزة لتعيين المعلمات وأوقات التعرض. ضع لوحة المراسل في الجهاز ثم ضع الشريحة في حامل المجهر لبدء التصوير. الحصول على صور للأنسجة الملطخة. قم بتثبيت أحدث إصدار من برنامج تحليل علم الأمراض الرقمي. انقر فوق إنشاء مشروع وحدد مجلد وجهة لمساحة المشروع. بعد ذلك ، انقر فوق إضافة صور ، متبوعا باختيار الملفات. ثم انتقل إلى ملف QuP TIFF الناتج عن التصوير المناعي المتعدد الإرسال. اضبط نوع الصورة على التألق، واحتفظ بالإعدادات الافتراضية، وانقر فوق Import. إذا كنت تستخدم QuPath، فانقر نقرا مزدوجا فوق الصورة الجديدة لفتح مساحة عمل، ثم اضغط على ملف وحفظ بشكل دوري لتتبع تغييرات المشروع. قم بتبديل رؤية العلامات وإعدادات العرض باستخدام أداة السطوع والتباين في شريط الأدوات. استخدم أداة الفرشاة أو العصا لرسم تعليق توضيحي حول قسم الأنسجة بأكمله. حدد هذا التعليق التوضيحي على أنه نسيج كامل مع استبعاد الجلد أو المناطق التي لا ينبغي تحليلها. اضغط مع الاستمرار على مفتاح ALT لإنشاء تعليقات توضيحية سلبية أو تقليص الحدود. الآن اختر التعليق التوضيحي بالنقر فوق علامة التبويب التعليقات التوضيحية والضغط على الكائنات متبوعة بالتعليقات التوضيحية ، ثم انقر فوق تكرار التعليقات التوضيحية المحددة. قم بتشغيل قناة SOX 10 ، ثم قم بتقليص التعليق التوضيحي المكرر لتحديد منطقة الورم باستخدام أداة ALT + الفرشاة / العصا. الآن حدد التعليق التوضيحي الكامل للأنسجة. ثم انتقل إلى الكائنات متبوعة بالتعليقات التوضيحية وتوسيع التعليقات التوضيحية. اضبط نصف قطر التمدد على ميكرومتر واحد وانقر فوق تشغيل. أعد تسمية هذا التعليق التوضيحي الجديد باسم توسيع الأنسجة الكاملة. حدد التعليق التوضيحي للورم، وانقر بزر الماوس الأيمن، وحدد إدراج في التسلسل الهرمي. أعد تحديد التعليق التوضيحي للورم، ثم انتقل إلى الكائنات، التعليقات التوضيحية، والآن انقر فوق Make Inverse. حدد هذا التعليق التوضيحي الجديد على أنه ستروما وكرر ذلك لجميع أقسام الأنسجة. لتشغيل تجزئة الخلية ، انقر فوق علامة التبويب صورة للعثور على عرض البكسل وارتفاع الصورة. قم بتنزيل امتداد StarDist من GitHub. قم باستيراد ملف StarDist.jar ملحق QuPath إلى QuPath. قم أيضا بتنزيل ملفات البرنامج النصي الرائع StarDist وملف الطراز من GitHub. لكل قسم من أقسام الأنسجة، حدد كلا من التعليقات التوضيحية للورم والسدى. في شريط الإعدادات، انقر فوق أتمتة متبوعا بمحرر البرامج النصية لفتح واجهة البرنامج النصي. افتح البرنامج النصي المناسب لتجزئة خلية StarDist المقابل لحجم بكسل الصورة. عند المطالبة، حدد StarDistcellsegmodel.pb لتجزئة الخلايا. بعد تجزئة الخلية ، احفظ الصورة ، ثم انقر بالتتابع فوق قياس ، وتصدير القياسات ، وحدد الصور المقابلة ، وقم بتعيين نوع التصدير كخلايا والفاصل .csv. اختر موقع ملف الإخراج، ثم انقر على تعبئة لتضمين المقاييس ذات الصلة. لكل علامة نسب لاستخدامها في التجميع أو النمط الظاهري ، حدد قيمة متوسطة واحدة للتصدير. لتطبيع البيانات البروتينية، افتح ملف CSV الذي تم تصديره واقتطع عناوين الأعمدة للاحتفاظ باسم العلامة فقط. بعد تثبيت أحدث إصدار من R & R Studio ، قم بتنزيل البرنامج النصي لتطبيع العلامة .r من GitHub وقم بتشغيله لتصفية الخلايا بناء على الحجم النووي. قم بإجراء الحد الأدنى/الحد الأقصى للتطبيع لكل علامة. بمجرد الانتهاء ، احفظ ملف CSV الجديد مع البيانات التي تم تسويتها. تم تأكيد اقتران الباركود للحمض النووي للأجسام المضادة عن طريق الرحلان الكهربائي للبروتين الهلامي ، مما يظهر نطاقات إضافية في منطقة السلسلة الثقيلة. أظهر التصوير المناعي المتعدد لأورام الجناح B16-F10 المعالجة بجسيمات نانوية 4-1BBL / IL-12 ومضاد PD1 الجهازي تعبيرا مميزا عن علامات المناعة عبر أقسام الورم. حدد تجميع FlowSOM نطاقا أوسع من شدة تعبير العلامات مقارنة بالتنميط الظاهري Seurat ، مع اختلاف أقصى في الشدة يبلغ حوالي 0.7 مقابل 0.5. صنف التنميط الظاهري FlowSOM أيضا عددا أكبر من البلاعم إلى أنواع فرعية M1 و M2. أظهر القياس الكمي لكثافات البلاعم أن FlowSOM اكتشف كثافات أعلى لكل من البلاعم M1 و M2 مقارنة ب Seurat ، بينما صنف Seurat المزيد من البلاعم على أنها أخرى. كشف التحليل المكاني أن M2 البلاعم والخلايا القاتلة الطبيعية لديها أعلى متوسط الحد الأدنى للمسافات بعد العلاج وأن M1 كانت البلاعم أكثر انتشارا حول خلايا CD8 التائية.