ضبط أوضاع الانقباض والتشوه للتجميعات النشطة القائمة على الأكتين في المختبر: من الشبكات النشطة ثنائية الأبعاد إلى قطرات البلورات السائلة

يركز هذا البحث على المواد البيولوجية اللينة ويهدف إلى استكشاف الآليات الفيزيائية الأساسية التي تنظم الشكل والتنظيم والمواد المستوحاة من الخلايا البيولوجية.

أنظمة النماذج البيولوجية والمختبرية معقدة بطبيعتها مع العديد من المزالق ، ويعد تحضير العينات أمرا بالغ الأهمية لقابليتها للتكاثر. تم تصميم هذا البروتوكول لتحسين قابلية التكرار في هذه الأنظمة.

تمهد هذه النتائج الطريق لاكتشاف وتوصيف الآليات وفهم وظيفة القوى الفيزيائية والمواد الحيوية. قد يكون هذا قابلا للتعميم على العديد من البوليمرات الحيوية والعضيات.

[الراوي] للبدء ، قم بإعداد العينة المراد تحميلها عن طريق إضافة خمسة ميكرولترات من المخزن المؤقت 10XF في أنبوب طرد مركزي صغير وإضافة حجم من الماء المقطر منزوع الأيونات بحيث يكون حجم العينة النهائي 50 ميكرولترا بعد إضافة المكونات المتبقية. ماصة ميكرولتر واحد من 25٪ بيتا ميركابتو إيثانول ، ميكرولتر واحد من 225 ملليغرام لكل مليلتر جلوكوز ، ميكرولتر واحد من خليط من الجلوكوز أوكسيديز و 85,000 وحدة لكل ملليلتر محفز في المحلول. ثم أضف ميكرولتر واحد من 25 ملليمولار ATP و 10 ميكرولتر من 2٪ ، 15 سنتيبواز ميثيل السليلوز ، واخلطه جيدا عن طريق سحب العينات. لبدء بلمرة الأكتين ، امزج الأكتين غير المسمى مع الأكتين المسمى وأضف مزيج الأكتين إلى محلول المخزن المؤقت F المحضر. ماصة المحلول لأعلى ولأسفل لضمان الخلط المناسب. اترك الأكتين يتبلمر في درجة حرارة الغرفة في أنبوب الطرد المركزي الصغير. بعد ذلك ، لتحضير خلية تدفق ، ضع قطعتين من الشريط على الوجهين متوازية مع بعضهما البعض عبر عرض شريحة المجهر لتشكيل حدود قناة خلية التدفق. ضع زلة الغطاء فوق قناة الشريط مع التأكد من أنها عمودية على شريحة المجهر. اضغط لأسفل على منطقة زلة الغطاء الملامسة للشريط على الوجهين لإنشاء ختم جيد وإزالة الجيوب الهوائية. باستخدام شفرة حلاقة ، قم بقص أي شريط زائد من شريحة المجهر وانزلاق الغطاء بحيث يكون الشريط المرئي الوحيد داخل قناة العينة. لتحضير حجرة عينة أسطوانية لعينتين من أجهزة إزالة السطح ، اشطف أولا زلة الغطاء بالإيثانول والماء والإيثانول. جففه بالهواء المصفى. ضع طبقة رقيقة من الإيبوكسي لمدة خمس دقائق للصق أسطوانة استنساخ الزجاج على زلة الغطاء. أضف 3.5 ميكرولتر من محلول الزيت الخافض للتوتر السطحي إلى أنبوب طرد مركزي دقيق شفاف أو فاتح اللون. بدون خلط ، ضع الماصة خمسة ميكرولترات من محلول الأكتين على الجزء العلوي من طبقة الزيت الخافض للتوتر السطحي. أغلق الأنبوب. أمسك الجزء العلوي من أنبوب الطرد المركزي الصغير ونفض الغبار على الحافة السفلية لتشكيل رغوة أولية مع مستحلب مرئي واستمر في النقر حتى تشكل مستحلبات دقيقة موحدة. قبل تحميل خلية التدفق ، امزج كمية صغيرة من الإيبوكسي لمدة خمس دقائق. لتحميل خلية التدفق، قم بإدخال ماصة من واحد إلى ثلاثة ميكرولترات من محلول الفاعل بالسطح بالزيت في قناة عينة خلية التدفق لإنشاء سدادة صغيرة تبلل القناة. قم بإمالة خلية التدفق لإزالة أي فجوة هوائية تتشكل بسبب انحسار الغضروف المفصلي الخافض للتوتر السطحي بالزيت قبل إضافة العينة. قم على الفور بسحب معلق مستحلب محلول العينة في مدخل خلية التدفق لملء القناة. أغلق كل جانب من قناة خلية التدفق بالإيبوكسي لمدة خمس دقائق. لتحميل حجرة عينة الأسطوانة للحصول على عينات غير مستحلب، قم بوضع خمسة ميكرولترات من محلول الزيت الخافض للتوتر السطحي في قاع حجرة الأسطوانة الزجاجية. قم بإمالة زلة الغطاء وتدويرها ببطء لتغطية السطح والأسطوانة السفلية بمحلول الفاعل بالسطح. قم بإزالة محلول الزيت الزائد الخافض للتوتر السطحي باستخدام ماصة للحصول على طبقة رقيقة مع منع التبخر الكامل للزيت. أضف محلول العينة على الفور إلى الغرفة. قم بتغطية الغرفة بقطعة صغيرة من شريط البولي تترافلورو إيثيلين ، أو شريط PTFE ، لمنع التبخر والتدفق. قم بتركيب العينة على مرحلة المجهر. ابدأ التصوير بفاصل زمني للأكتين باستخدام هدف 20x أو 40x أو 60x أو 100x مع الغمر بالزيت أو الماء لضمان فتحة عدلية عالية بما فيه الكفاية للتصوير عالي الدقة. في حالة البلمرة في غرفة العينة ، اترك البلمرة لمدة 30 دقيقة تقريبا أو حتى لا يكون هناك إطالة أو حركة مرئية للفتيل. أضف رابطا متقاطعا إلى العينة ، ثم أضف الميوسين كخيوط مبلمرة مسبقا عن طريق سحب ما يقرب من نصف الحجم الكلي ببطء في العينة. أخيرا ، ابدأ التصوير بفاصل زمني. تظهر هنا صورة التألق متحد البؤر التمثيلية لشبكة الأكتين المتشابكة. يتم توزيع شبكة الأكتين المتشابكة بشكل موحد عبر السطح. تمثل النقاط المضيئة في هذه الصورة تداخلات خيوط ، بينما تشير المناطق المظلمة إلى الحد الأدنى من وجود الأكتين. تؤدي التقلبات الحرارية إلى تغيرات في الشدة المحلية والانحناء المرئي لخيوط الأكتين. تؤدي إضافة الميوسين الثاني إلى ثني وإعادة تنظيم شبكة الأكتين مع تراكم مرئي لنقط الميوسين في أوقات طويلة. يعتمد تقلص الشبكة على تركيز الميوسين وتركيز ATP. في شبكات الأكتين المتشابكة ، يؤدي الانكماش الناجم عن الميوسين إلى حركة منسقة على نطاقات طول أطول مقارنة بالشبكات المتشابكة.