في Ovo تطعيم خلايا ابيضاض الدم الليمفاوي الحاد (ALL) المشتق من المريض (PDX-ALL)

نطاق هذا البحث هو بيولوجيا السرطان ، مع التركيز على تحديد الاستراتيجيات العلاجية لعلاج السرطان. نموذج ابيضاض الدم الليمفاوي الحاد المشتق من المريض في البيض مقيد بنافذة تجريبية قصيرة نسبيا تبلغ حوالي 10 أيام ، مما يحد من الدراسات طويلة المدى حول تطور ابيضاض الدم الليمفاوي الحاد أو الاستجابة للأدوية بعد هذا الإطار الزمني. يضع هذا البروتوكول طريقة سريعة وفعالة من حيث التكلفة لتحويل الخصف في الحوض لخلايا سرطان الدم الليمفاوي الحاد المشتقة من المريض ، بما في ذلك سلالات الخلايا البائية والخلايا التائية.

يمثل هذا البروتوكول أداة واعدة لفحص الأدوية قبل السريرية والدراسات الميكانيكية ومناهج الطب الشخصية المحتملة في أبحاث سرطان الدم. سيتم استكشاف جدوى استخدام نموذج xenograft المعمول به في ovo للتطبيقات قبل السريرية. للبدء ، انقل البيض المشتراة إلى حاضنة درفلة مرطبة مضبوطة على رطوبة تتراوح من 50 إلى 60٪ تقريبا ودرجة حرارة 39 درجة مئوية.

احتضن البيض في هذه الحاضنة لمدة 10 أيام بعد الإخصاب. انقل عينات الدم إلى أنبوب طرد مركزي معقم سعة 50 ملليلتر وقم بتخفيف كل عينة ثلاث مرات باستخدام مجلدين من PBS. بعد طرد العينة مع وسط تدرج الكثافة ، اجمع طبقة الطبقة المصرة للخلايا أحادية النواة من الواجهة وانقلها إلى أنبوب جديد معقم سعة 15 مل.

أضف 10 ملليلتر من PBS إلى الأنبوب وقم بالطرد المركزي للأنابيب عند 300 جم لمدة خمس دقائق لإزالة مكونات المصل المتبقية. أعد تعليق الخلايا المحببة في وسط RPMI 1640 المكمل ب 10٪ FBS. استخدم مقياس الخلايا الدموية لحساب عدد الخلايا.

أعد تعليق الخلايا في وسط تجميد يتكون من 10٪ DMSO في FBS. قم بتقييم صلاحية الخلية باستخدام مقايسة استبعاد التريبان الأزرق وقم بتجميد الخلايا عند 80 درجة مئوية تحت الصفر وتخزينها في النيتروجين السائل. بعد ذلك ، قم بنقل 1.5 مليون خلية تائية HEK 293 مع ناقل البلازميد المطلوب باستخدام Lipofectamine 3000 واحتضان الخلايا المنقولة لمدة يومين.

احصد المادة الطافية التي تحتوي على فيروس عدسي من الآبار وقم بتصفيته من خلال مرشح 0.45 ميكرومتر لإزالة الحطام. انقل المادة الطافية الفيروسية المفلترة إلى أنابيب الطرد المركزي وأجهزة الطرد المركزي عند 20،000 جم لمدة ساعتين عند أربع درجات مئوية. لوضع العلامات ، قم بوضع 1 مليون خلية لكل مليلتر من خطوط خلايا SEM و T-cell MOLT3 بالإضافة إلى خلايا سرطان الدم الليمفاوي الحاد B أو T المشتقة من المريض في صفائح بستة آبار تحتوي على RPMI 1640 مع 10٪ FBS.

تصور الخلايا المسمى mCherry تحت مجهر مضان. في اليوم 10, فحص الأوعية الدموية لأجنة الكتاكيت تحت الضوء لتقييم صلاحية الجنين, اغسل سطح كل بويضة برفق مع 70٪ الإيثانول. باستخدام مثقاب يدوي ، قم بالحفر في الخلية الهوائية لكل بيضة لإنشاء نافذة صغيرة قطرها حوالي سنتيمترين.

أغلق النافذة التي تم إنشاؤها بشريط لاصق شفاف وأعد البيض إلى حاضنة ثاني أكسيد الكربون بنسبة 5٪. في اليوم 11 ، قم بحقن 10 ملايين خلية سرطان الدم الليمفاوي الحاد المسمى mCherry في الأوعية الدموية للأجنة النامية باستخدام إبر قياس 34. بعد إغلاق النافذة ، أعد البيض إلى حاضنة ثاني أكسيد الكربون بنسبة 5٪ وراقب صلاحية الجنين يوميا.

في اليوم 15 ، قم بتشريح الأوعية الدموية من الأجنة. ضعها على شرائح زجاجية وقم بتصوير الطعوم الغريبة الناجحة باستخدام مجهر تشريح مزود بإمكانيات التألق. اجمع الدم من الأوعية الدموية لأجنة الدجاج باستخدام حقنة معقمة بإبرة قياس 32.

انقل الدم إلى أنبوب معقم سعة 1.5 ملليلتر يحتوي على الهيبارين وجهاز طرد مركزي عند 226 جم لمدة 10 دقائق عند أربع درجات مئوية. قم بتسمية خلايا ابيضاض الدم الليمفاوي الحاد للخلايا البائية مع FITC CD10 البشري والأجسام المضادة PE CD19 البشرية وخلايا سرطان الدم الليمفاوي الحاد للخلايا التائية مع FITC CD4 البشري والأجسام المضادة PE CD8 البشرية عند أربع درجات مئوية في الظلام لمدة 30 دقيقة. اغسل الخلايا المصنفة مرتين باستخدام PBS الذي يحتوي على 1٪ BSA وقم بالتحليل باستخدام قياس التدفق الخلوي ، كان استعمار الأوعية الدموية بواسطة خطوط خلايا SEM و MOLT3 مرئيا بوضوح بعد أربعة أيام من الحقن ، مما يؤكد النقش الناجح في الأوعية الدموية لجنين الدجاج النامية.

أظهرت خلايا B-all و T-all المشتقة من المريض إشارات فلورية قوية في الأوعية الدموية بعد أربعة أيام من الحقن ، مما يشير إلى الاستعمار النشط والانتشار في الأوعية الدموية. كشف قياس التدفق الخلوي عن زيادة كبيرة في الخلايا الإيجابية CD10 / CD19 في الأجنة المحقونة ب SEM وخلايا B-all المشتقة من المريض في أربعة أيام بعد الحقن مقارنة بالضوابط التي تم جمعها بعد ست ساعات من الحقن. وبالمثل ، كانت الخلايا الإيجابية CD4 / CD8 أعلى بشكل ملحوظ في الأجنة المحقونة ب MOLT3 والخلايا التائية المشتقة من المريض في أربعة أيام بعد الحقن.