إنشاء نماذج في المختبر لثقافة العقد الجذرية الظهرية: مناهج تكميلية للتحقيق في الحديث المتبادل بين السرطان والأعصاب

يركز بحثنا على الحديث المتبادل بين السرطان والأعصاب ، باستخدام عقد الجذر الظهرية ثلاثية الأبعاد أو نباتات DRG والثقافات المنفصلة ثنائية الأبعاد لتحديد هجرة الورم الموجهة عصبيا واختبار الاستراتيجيات الجزيئية للحد من تفاعلها. باستخدام هذا البروتوكول ، أنشأنا مزارع DRG ثلاثية الأبعاد و ثنائية الأبعاد تكميلية ، وتحسين نمو العصبية ، وأظهرنا زيادة في غزو الخلايا السرطانية على طول امتدادات العصب. لقد عالجنا الافتقار إلى النماذج القابلة للتكرار التي تلتقط كلا من التفاعلات المعقدة على مستوى الخلية والبنية العصبية السليمة من خلال إنشاء مزارع DRG ثنائية الأبعاد و ثلاثية الأبعاد تكميلية من فأر واحد.

ينتج بروتوكولنا نباتات ثلاثية الأبعاد مقترنة ومزارع الخلايا العصبية ثنائية الأبعاد من فأر واحد ، مما يحافظ على الملمس الزاوي ، ويتيح التصوير عالي المحتوى ، ويقلل من استخدام ، ويسمح لنا بالحصول على بيانات مستوى الأنسجة والخلية المفردة في تجربة واحدة. فتح نموذجنا أسئلة حول العوامل التي أنشأتها DRG وهي الغزو ، وكيف يشكلها نشاط الخلايا العصبية والعمر والنمط الجيني ، وما إذا كان استهداف مستقبلات عامل التغذية العصبية يمكن أن يقلل من انتشار السرطان الموجه إلى العصب. للبدء ، ضع فأرا مروحا على بطنه.

احلق الفراء ، مع التركيز على المنطقة الموجودة فوق العمود الفقري لفضح السطح الظهري. رش 70٪ إيثانول على ظهر. باستخدام المناشف الورقية ، امسح من الذيل إلى الجمجمة لإزالة أي فراء فضفاض ومنع التلوث أثناء التشريح.

باستخدام زوج من المقص المعقم ، قم بعمل شق مستقيم على طول خط الوسط الظهري من الذيل إلى الجمجمة. باستخدام ملقط حاد ، اسحب الجلد على جانبي الشق لكشف العمود الفقري. الآن ، استخدم زوجا جديدا من المقص والملقط لتجنب التلوث وعمل شق أفقي في نهاية ذيل العمود الفقري.

ثم قم بعمل شقين طوليين متوازيين على جانبي العمود الفقري لتحريره. استخدم الملقط لرفع العمود الفقري برفق وإزالة النسيج الضام المحيط. لتحرير العمود الفقري بالكامل ، قم بعمل شق في الجزء العلوي من العمود الفقري بالقرب من الجمجمة.

انقل العمود الفقري إلى صفيحة مبردة مسبقا يبلغ طولها 10 سم تحتوي على HBSS مع البنسلين ستربتومايسين المحفوظ على الجليد. بعد ذلك ، استخدم مقصا زنبركيا لإزالة أي نسيج ضام متبقي من العمود الفقري وكشف الفقرات. انقل العمود الفقري المشذب إلى مرحلة المجهر.

قم بتقسيم العمود بعناية على طول المستوى السهمي باستخدام مقص زنبركي. باستخدام ملقط رفيع الرؤوس ، قم بإزالة الحبل الشوكي من العمود للكشف عن العقد الجذرية الظهرية على طول جذور الأعصاب الشوكية. قطع الأعصاب الشوكية باستخدام مقص الربيع.

ثم قم بإزالة أي نسيج ضام محيط من عقد الجذر الظهري. باستخدام ملقط رفيع الرؤوس ، استخرج العقد الجذرية الظهرية برفق من الجذور الظهرية. بالنسبة للثقافة الكاملة ، ضع DRGs في صفيحة طولها ثلاثة سنتيمترات تحتوي على HBSS مع البنسلين ستربتومايسين المحفوظ على الجليد.

استخدم أطراف الماصة المبردة مسبقا لتوزيع ميكرولترين من ماتريجل المبردة في كل بئر من شريحة ذات قاع زجاجي مكونة من ثمانية آبار موضوعة داخل صفيحة طولها 10 سم على الثلج. لمنع البلمرة المبكرة ، قم بعمل قطرة واحدة فقط في كل مرة. بعد ذلك ، استخدم ملقطا رفيع الرؤوس لوضع عقدة جذر ظهرية واحدة على طبق جاف.

حركه برفق لإزالة HBSS الزائد. ثم انقل عقدة الجذر الظهرية النظيفة إلى قطرة Matrigel. بعد نقل جميع العقد إلى القطرات ، احتضن شريحة القاع الزجاجي في حاضنة مرطبة عند 37 درجة مئوية لمدة خمس دقائق للسماح للمادة بالبلمرة.

بعد ذلك ، أضف بعناية 200 ميكرولتر من وسائط الاستزراع الدافئة الدافئة إلى كل بئر. احتضان الشريحة عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون. استخدم الفحص المجهري للحقل الساع لمراقبة العقد الجذرية الظهرية يوميا لنمو الخلايا العصبية وقابليتها للحياة.

جهاز طرد مركزي عبارة عن أنبوب مخروطي سعة 15 مل يحتوي على عقد جذر ظهرية مجمعة عند 200 جرام لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة. بعد سحب العينة HBSS ، اشطف العقد بوسائط مكملة مسبقة التسخين ، واضغط برفق. ثم قم بالطرد المركزي للأنبوب لمدة خمس دقائق عند 200 جرام لتكوير DRGs.

استبدل الوسائط بملليلتر واحد من محلول غراء تخلط برفق وتحتضن عند 37 درجة مئوية في حاضنة زراعة الأنسجة لمدة 20 دقيقة ، مع التقليب برفق كل خمس دقائق. بعد ذلك ، أضف 10 ملليلتر من الوسائط المكملة لتحييد غراء ، واخلطها برفق.

جهاز طرد مركزي لمدة خمس دقائق عند 400 جرام لحبيبات العقد الجذرية الظهرية. بعد سحب المادة الطافية، أضف مليلترا واحدا من الكولاجيناز من النوع الرابع في محلول Dispase II، واحتضنه مرة أخرى. أضف 4.5 مل من الوسائط المكملة لتحييد محلول الإنزيم ، واخلطه برفق وجهاز طرد مركزي.

بعد إخراج المادة الطافية ، أضف خمسة ملليلتر من الوسائط المكملة. ثم أضف Dnase I للوصول إلى تركيز نهائي قدره 0.2 ملليغرام لكل مليلتر. يجب أن تظهر العقد الجذرية الظهرية الآن ككتلة فضفاضة ، مما يشير إلى الهضم الكامل.

للتفكك الميكانيكي، استخدم طرف ماصة مرشح سعة 1,000 ميكرولتر لتثبيث محلول العقد عن طريق سحب العاصة لأعلى ولأسفل أربع إلى خمس مرات. قم بالتبديل إلى طرف ماصة سعة 200 ميكرولتر وكرر التبريت عن طريق سحب العينة من أربع إلى خمس مرات. قم بتصفية التعليق الغائم الناتج من خلال مصفاة خلية 70 ميكرومتر في أنبوب مخروطي سعة 50 مل.

ثم اشطف المصفاة تدريجيا ب 10 ملليلتر من الوسائط لضمان النقل الكامل للخلايا. قم بالطرد المركزي لتعليق الخلية المفلتر لمدة خمس دقائق عند 1 ، 000 جرام لحبيبات الخلايا. قم بإزالة الوسائط من الحبيبات ، وأعد تعليق حبيبات الخلية في 500 ميكرولتر من الوسائط المكملة.

قم بإزالة أي بقايا PBS من آبار الشريحة ذات القاع الزجاجي المكونة من ثمانية آبار. وزع معلق العقد الجذرية الظهرية المنفصلة في الآبار المغلفة بالكولاجين ، واحتضانها. استخدم الفحص المجهري للمجال الساطع لمراقبة الخلايا المشتقة من عقد الجذر الظهري يوميا ، وتقييم صلاحية الخلية ونمو الخلايا العصبية للاستزراع المشترك لعقد الفأر بأكملها مع الخلايا السرطانية ، قم أولا بشفط الوسائط من مزارع DRG الكاملة على الشريحة ذات القاع الزجاجي المكون من ثمانية آبار.

باستخدام ماصة ، أضف برفق 200 ميكرولتر من معلق الخلية السرطانية إلى البئر الذي يحتوي على قطرة Matrigel والعقد الجذرية الظهرية. احتضان شريحة الزراعة المشتركة في حاضنة مرطبة عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون. قم بتحديث الوسائط يوميا عن طريق غسلها مرة واحدة ب 200 ميكرولتر من الوسائط الدافئة الدافئة ، وأضف 300 ميكرولتر من الوسائط الطازجة.

من أجل الزراعة المشتركة للعقد المنفصلة والخلايا السرطانية ، قم بشفط الوسائط من مزارع DRG المنفصلة على شريحة القاع الزجاجي ذات الثمانية آبار. ثم وزع برفق 200 ميكرولتر من تعليق الخلايا السرطانية في كل بئر قبل الحضانة. كان إنشاء DRG أقل كفاءة في غياب المكملات الغذائية وانخفض امتداد النيوريت بشكل ملحوظ.

أنتجت DRGs الكاملة من الأكبر سنا امتدادا عصبيا أقل غزارة وأكثر تميزا والحد الأدنى من الخلايا الدبقية ، مما يسهل تصور تفاعلات الخلايا السرطانية العصبية. أدى تفكك الخلايا العصبية DRG باستخدام خطوتين إنزيميتين إلى انتعاش أعلى للخلايا العصبية. في غضون 24 ساعة من الثقافة ، أصبحت الخلايا غير العصبية ، مثل خلايا شوان والضامة والخلايا الليفية ، واضحة ، بينما لوحظت الخلايا العصبية التي تنبت من الخلايا المشتقة من DRG وزادت بعد 72 ساعة.

غزت الخلايا السرطانية المزروعة في إدخالات الحيل المغلفة ب Matrigel خلايا HEC293 ، ولكن ليس باتجاه الخلايا العصبية DRG بعد 24 ساعة من الحضانة. سمحت مزارع DRG الكاملة المغمورة في قطرة Matrigel بتمديد النيوريت إلى الخارج عبر المصفوفة باتجاه المحيط. مع الوضع الدقيق ل DRG مركزيا في القطرة ، مما يوفر أقصى امتداد للعصبية دون زيادة الحدود.

استقرت الخلايا السرطانية بعد 12 ساعة من الزراعة المشتركة حول حدود قطرة Matrigel التي تحتوي على DRG. بعد 72 ساعة من الزراعة المشتركة ، غزت الخلايا السرطانية مادة العقد وتحركت نحو العقدة ، مع تفاعل مباشر بين امتدادات الخلايا العقدية الجذرية الظهرية والخلايا السرطانية التي لوحظت. سمحت الزراعة المشتركة للخلايا المشتقة من DRG المنفصلة مع الخلايا السرطانية بتصور مفصل لتفاعلات الخلايا الفردية.