تصنيع مصفوفة دماغية قابلة للتوسع قابلة للتخصيص عبر مراحل النمو

تصنيع مصفوفة دماغية قابلة للتوسع قابلة للتخصيص عبر مراحل النمو، بواسطة تشابمان وزملائه في جامعة كنتاكي في ليكسينغتون، كنتاكي. تطور دماغ الخنزير الصغير مشابه جدا لدماغ الإنسان في عدة جوانب. مقارنة بالفئران والجرذان، فإن نسبة وزن دماغ الخنزير الصغير من الولادة إلى النضج أقرب بكثير إلى البشر، والمناطق الوظيفية للخنزير الصغير والدوشج والدماغ الرأسي متشابهة جدا.

لهذه الأسباب، يتزايد استخدام الخنازير والثدييات الكبيرة الأخرى في أبحاث علم الأعصاب. ومع ذلك، فإن مصفوفات الدماغ التجارية للثدييات الأكبر مكلفة، وغالبا ما تقتصر الخيارات على حجم أو مستوى تقسيم واحد. وبالتالي، قد لا توفر المصفوفات التجارية ملائمة لسلالات مختلفة، ذكور وإناث، وأعمار مختلفة.

وهذا يمثل مشكلة خاصة في دراسات علم الأعصاب التطوري، حيث يتغير حجم الدماغ بشكل ملحوظ مع النمو بعد الولادة. على سبيل المثال، تنمو أدمغة الخنازير الصغيرة بسرعة خلال الأشهر الثلاثة الأولى، وتزداد حجمها بأكثر من ثلاثة أضعاف. مصفوفة دماغ الخنازير التجارية مصممة لتناسب أدمغة خنازير صغيرة تصل إلى عمر أسبوعين فقط.

هنا نقدم طريقة بناء مصفوفة قابلة للتخصيص تعتمد على ألواح الأكريليك كحل فعال من حيث التكلفة وسهل التنفيذ لهذه المشكلة. تم الحصول على أربعة خنازير ساذجة عمرها أربعة أيام لهذا التجربة. تم استخدام واحدة لجمع الدماغ في عمر خمسة أيام، واثنتان في عمر 32 يوما، وواحدة عند عمر 38 يوما.

بعد إزالة الدماغ من الجمجمة، تم تثبيت الدماغ في 10٪ من الفورمالين المخزن لمدة يومين، ووضعه في محلول السكروز بنسبة 30٪ لمدة خمسة أيام للحفاظ على التجميد. سنعرض بعد ذلك كيفية صنع قالب للدماغ باستخدام جل الأجاروز. الخطوة الأولى لصنع المصفوفة هي صنع قالب للدماغ.

سنوضح عملية إنشاء قالب لدماغ خنزير صغير بعد الولادة في اليوم الخامس، والذي سيستخدم لبناء مصفوفة سهمية. ضع شريطا من البلاستيك القوي في قاع الحاوية الزجاجية، مع التأكد من ترك الطرفين يمتدان خارج حواف الحاوية. هذا الشريط سيجعل استخراج كتلة الأغاروز أسهل.

اغمر الحاوية في نصف دلو من الثلج المبلل. في كأس زجاجي، سخن 150 ملليتر من PBS إلى 90 درجة مئوية وأضف ستة جرامات من الأغاروز، مع التحريك باستمرار. صب محلول الأغاروز بنسبة 4٪ ببطء لتكوين طبقة بسماكة نصف إلى سنتيمتر واحد في قاع الحاوية ودعها تتصلب.

غط الدماغ بالكامل بطبقة رقيقة من الزيت المعدني لمنع الأجاروز من الارتباط بسطح الدماغ أو الاحتجاز في التلسي. كما أن الزيت يجعل إزالة الدماغ من جل الأغاروز أسهل بكثير. بعد التغطية، ضع الدماغ على الطبقة الرقيقة من الأغاروز في الاتجاه المطلوب ليكون العفن الإكليلي أو السهمي مستقيما ومستقيما قدر الإمكان.

اترك محلول الأجاروز ليبرد إلى 50 درجة مئوية مع التحريك المستمر للحفاظ على اللزوجة القابلة للصب. ثم صب محلول الأغاروز فوق الدماغ حتى يغرس تماما. دع الأغاروز يتصلب في درجة حرارة الغرفة.

اقطع طبقة الأغاروز فوق الدماغ بمسبار جراحي باتباع مخطط الدماغ. بمجرد اكتمال القطع حول الدماغ، استخدم ملعقة رقيقة لرفع الطبقة العلوية من الأجاروز برفق. احرص على عدم قطع أو قطع الدماغ أثناء هذه الخطوات.

أزل الدماغ بالكامل من العفن بلطف. يجب أن يخرج بسهولة نسبية بسبب الزيت المعدني الذي وضع على السطح سابقا. تأكد من إزالة أي قطع صغيرة من جل الأغاروز قد تكون سقطت في الانطباع.

سخن 98 ملليتر من PBS في كأس إلى 9 درجات مئوية وأضف أربعة جرامات من الأجوروز واثنين ملليلتر من حبر الهند. حرك جيدا. صب هذا المحلول الأجوروز الأسود في الانطباع الذي يتركه الدماغ، مع الحرص على عدم الفيض من الانطباع.

دع الجل الأسود يتصلب. أمسك طرفي الشريط البلاستيكي وارفع كتلة الأغاروز بالكامل من الحاوية. سنوضح الآن كيفية إنشاء لوحات قوالب لمصفوفتك المستخدمة.

لتقطيع قالب الدماغ، ضع قطعة ورق مقياس واحدة بين لوحين أكريليك شفافين بحجم 76 ملم وضعهما بالقرب من حافة الطاولة. ثم استخدم مشابك لتثبيت أربعة مربعات في الزوايا ولوحين من الأكريليك لبناء جدارين لتثبيت كتل الأغاروز بإحكام في الاتجاه المطلوب. يجب محاذاة الحواف الأمامية لمربعي الزوايا المعدنية ولوحين أكريليك عموديين على جانب واحد من ورق الميزان.

ضع كتلة جل الأغاروز بحيث تتوافق الحافة المراد قصها على ورق الميزان ومع حواف ألواح الأكريليك الرأسية ومربعات الزوايا، وضع وزنا على الجانب المقابل من كتلة الأغاروز لتثبيتها في مكانها. قم بقص أي فائض من القطعة حتى يكون قالب الدماغ الهندي على وشك القطع. حرك كتلة الأغاروز للأمام بخطوات مرغوبة، مثل مليمترين أو خمسة مليمترات بمساعدة العلامات على ورق القياس الأساسي.

أمسك الشفرة بقوة بكلتا يديك ووجهها على الحواف الأمامية لكل من ألواح الأكريليك ومربعات الزوايا لتقطيع القطعة. ضع كل شريحة على ورقة مقياس ثانية واضغط بقوة لنقل انطباع على الورق. باستخدام قلم، رسم الشريحة كاملة.

أزل الشريحة وحدد الشكل الدماغي الذي حدده الحبر الهندي. لاحظ اتجاه الشريحة الأولى على ورق القياس، على سبيل المثال، الخلفية والأمامي للأقسام السهمية، وحافظ على اتساقها عند إضافة شرائح هلام إضافية إلى الورق طوال العملية. قم بترقيم كل واحد بالتسلسل.

اقطع ألواح الأكريليك إلى 10 × 8 1/2 سنتيمتر. ثم تكدسها وتثبيتها في مرحلة مكبس الحفر باستخدام مربعات وملابك في الزوايا. احفر ثلاث ثقوب في المدخنة مع الإحداثيات الموضحة في المخطوطة.

أزل الفيلم الواقي من ألواح الأكريليك. ثم ضع صفيحة أكريليك فوق قالب على ورق المقياس ومحاذاة أعلى خطوط لوح الأكريليك مع الحواف العلوية للقالب. ارسم حدود الدماغ على لوحة الأكريليك باستخدام قلم دائم.

ضع علامة على كل لوحة لتطابق رقم القالب أو تتبع الدماغ. باستخدام المنشار الشريطي، قص كل لوحة على طول خطوط القالب المنسوخة. بدلا من ذلك، يمكن استخدام أداة دوارة ذات طرف نحت خشبي لإزالة المناطق غير المرغوب فيها.

قم بتلميع حافة القطع باستخدام أداة دوارة مع رأس صنفرة تلميع لتنعيم الحواف لأن الحواف الحادة قد تضر الدماغ أثناء القطع. أعد التحقق من دقة القطع بوضع لوحة الأكريليك فوق القالب. قم بتقليم وتلميع حسب الحاجة.

بعد ذلك، سنوضح تجميع اللوحات. قم بتجميع المصفوفة مسبقا عن طريق تكديس الألواح بترتيب متسلسل وفحص محاذاة الألواح. يبدأ تجميع المصفوفة بوضع ثلاثة مسامير طويلة من الفولاذ المقاوم للصدأ عبر أول لوح أكريليك ثم وضع غسالة على كل برغي.

ضع اللوحة الثانية وأضف غسالات لكل برغي. بدلا من ذلك، يمكن لصق الغسالات حول فتحات التثبيت باستخدام الغراء الفائق لتجنب إضافة الغسالات بشكل فردي أثناء كل تركيب. كرر هذه العملية حتى تتم إضافة جميع الألواح بشكل متسلسل إلى البراغي.

شد كل شيء معا باستخدام صمولة على كل مسمار. قم بإجراء تلميع نهائي للحواف المواجهة للدماغ لجعل الانتقال أكثر سلاسة من لوحة إلى أخرى. استخدم أقلام تحديد ملونة مختلفة لتلوين الحافة العلوية لألواح الأكريليك بألوان متناوبة لتسهيل التقطيع.

هنا بدأنا بالتناوب بين الأسود والأحمر ولوحات غير معلمة. وأخيرا، سنعرض عملية تقطيع الدماغ في المستوى الإكليجي أو السهمي. لتقطيع الدماغ، ضعه في المصفوفة بنفس الاتجاه الذي كان عليه أثناء عملية التشكيل وبأقصى استقامة ممكنة.

ستحتاج إلى شفرة عريضة ومسطحة لقطع الدماغ. الشفرة العريضة تحد من احتمال الالتواء أو الانحناء أثناء التقطيع. نوصي بشفرة كريوستات عالية الارتفاع.

للسلامة، لف حوالي سنتيمترين من أحد طرفي الشفرة بشريط لاصق لخلق مساحة آمنة لتثبيت الطرف الملفوف أثناء تقطيع الدماغ. ملاحظة تحذيرية هنا. نظرا لأن كل جزء من الدماغ له ملمس مختلف بعد تثبيت الفورمالين، يجب الحذر لتطبيق ضغط متساو على النصل.

علاوة على ذلك، دماغ الخنزير الصغير كبير، لذا من الأفضل استخدام حركة تقطيع لقطع الدماغ بدلا من القطع المباشر والدفع للأسفل. يجب سحب الشفرة بقوة مستمرة من جانب إلى آخر، مع التأكد من أن تقطع الدماغ بأكمله بما يكفي للأسفل بما فيه الكفاية. ضع جميع الشرائح في طبق بستة آبار أو صينية من الفولاذ المقاوم للصدأ مملوءة ب PBS.

ضع الشرائح بعناية في الصينية، مع الحفاظ على ترتيب الشرائح واتجاهها، وحافظ عليها أو استمر عند الحاجة. لتعديل الهندسة أو توسيع التجويف لتناسب الدماغ بشكل أفضل، يمكن إزالة أو إضافة ألواح أكريليك مختارة لتكييف المصفوفة لتناسب أحجام مختلفة من الدماغ. هنا نوضح توسع مصفوفة السهمية المبنية لدماغ خنزير صغير من نوع P5 بإضافة عدة صفائح، هنا ملونة بالأزرق والأخضر، إلى الجزء الأوسط من المصفوفة.

المصفوفة الآن مناسبة لتقسيم الخنزير الصغير P38 بالتقسيم السهمي. القدرة على توسيع أو تقليل حجم المصفوفة تزيد بشكل كبير من مرونة المصفوفة ويمكن أن توفر المواد والجهد معا. كما هو الحال مع القطع الإكليلي، اقطع الدماغ بعناية في مستوى السهمية باستخدام صفائح متتالية لتوجيه النصل.

يساعد نظام ترميز الألوان في تحديد الوضع التسلسلي الصحيح للنصل، وهو أمر صعب عندما تكون الشرائح رفيعة. أزل الدماغ من المصفوفة وقم بتقشير الشرائح بلطف. في الختام، طورنا طريقة سهلة ومريحة من حيث التكلفة ومرنة لإنشاء مصفوفات دماغية للخنازير الوليدة.

يمكن تطبيق هذا المفهوم على الخنازير الأكبر سنا ونماذج الحيوانات الكبيرة الأخرى.