التصوير عالي الضفجة باستخدام الفحص المجهري متحد البؤر الطيفي لتقليل مضان الأنسجة غير المحدد
أكتوبر 28, 2025
يعتمد التبييض التكراري الطيفي يمتد على تقنية IBEX الأساسية عن طريق إضافة حجب الهيبارين لتقليل الارتباط غير المحدد والاستفادة من الكشف الطيفي مع فك الخلط الحسابي لقمع التألق الذاتي. يعمل هذا النهج على تسريع الحصول على الصور مع تقليل مصادر الخلفية ، مما يتيح تحليلات بروتينية مكانية قوية متعددة الجولات وعالية المعلمات.
نقوم بتحسين سير عمل IBEX يجمع بين حجب الهيبارين والكشف الطيفي لقمع الخلفية في الأنسجة البشرية الغنية بالإيوزينوفيل. الفلورة الذاتية وارتباط الحبيبات الإيوزينوفيلية تغيب الإشارة الحقيقية. نستهدف كلاهما لتمكين خرائط High Plex النظيفة.
للبدء، ارسم دائرة على الشريحة الزجاجية حول المنديل المثبت باستخدام قلم عنق الرحم لإنشاء حاجز كاره للماء. أضف حوالي 100 ميكرولتر من PBS إلى كل نسيج لإعادة ترطيبه، وحضن الشريحة لمدة دقيقتين تقريبا في درجة حرارة الغرفة لغسل المركب الأمثل لدرجة حرارة القطع. استنشق PBS من حول الأنسجة باستخدام ماصنة باستور زجاجية شفط.
ثم أضف 100 ميكرولتر من الحاجز الحاجز لكل نسيج، واحتضنه في درجة حرارة الغرفة في غرفة رطوبة لمدة ساعة. الآن استنشق مخزن الانسداد باستخدام ماصة. أضف 100 ميكرولتر من التلوين ممزوجة إلى كل منديل وحضن السلايد في غرفة رطوبة مغطاة داخل ثلاجة عند درجة حرارة أربع درجات مئوية طوال الليل.
وبالمثل، جهز مقطعا مصبوغا بفلوروفور واحد فقط وجهاز تحكم سلبي بدون أي صبغة لتحديد طيف الفلوروفور والفلورة الذاتية للأنسجة. بعد استنشاق خليط التلوين، اغسل المنديل ثلاث مرات باستخدام PBS، ثم استنشق السائل بعد كل غسل. ثبت العينة على المجهر للتصوير.
ركز على العينة باستخدام وضع التباين بالحقل الساطع أو التداخل التفاضلي. ثم التحول إلى وضع الفلورة وتكوين معلمات الاكتساب الطيفي وفقا لمتطلبات التجريب. خصص الليزرات المناسبة للفلوروفورات المستخدمة في التجربة.
اختر مقسم شعاع يتوافق مع خطوط الليزر المختارة. تمكين جميع الكواشف من التقاط طيف الانبعاث الكامل، وضبط دقة التقاط الصورة إلى إحدى الدقة المحددة مسبقا. أو اختر أقصى دقة.
قم بضبط حجم الثقب الدبوس ليكون وحدة منطقة واحدة للحصول على أفضل تقسيم بصري. قم بتحسين إعدادات الليزر قبل الحصول عليها. باستخدام قسم مصبوغ بجميع العلامات، ابدأ وضع المسح المستمر عند طاقة ليزر منخفضة.
قم بضبط كسب الماستر لكل كاشف وكذلك شدة الليزر حتى تصبح جميع العلامات قابلة للتعرف على نسبة إشارة إلى خلفية جيدة. قم بضبط شدة الليزر بدقة والتناوب بشكل تكراري بين أقسام الصبغة الواحدة والمتعددة حتى تصبح جميع إشارات الفلوروفور مرئية دون تشبع زائد. قم بتمكين ميزة البلاطات في برنامج الاستحواذ وحدد منطقة اقتناء البلاط حول النسيج لضمان تغطية الصورة الكاملة.
قم بتحسين التركيز لمنطقة اكتساب البلاط في مركز النسيج. تحديد ميزة هيكلية فريدة مثل مجموعة مميزة من الخلايا في ترتيب يمكن التعرف عليه لتكون مرجعا للمحاذاة في جولات التصوير اللاحقة. الآن قم بتفعيل ميزة Z-stack وانتقل إلى تبويب Z-stack.
تحت علامة التبويب المركزية، اضبط عدد الشرائح إلى ست على الأقل مع فاصل لا يقل عن ميكرومتر واحد بين الشريحات. انقر على زر المركز لتعيين نقطة التركيز الحالية التي تم تحديدها في الخطوة السابقة كشريحة وسط من التكديس. انقر على زر بدء التجربة لبدء التقاط الصورة.
بعد اكتمال عملية الاستحواذ، انقر بزر الفأرة الأيمن على الصورة المصغرة، اختر الحفظ باسم. اختر موقع الملف وسم الصورة. قم بعمل نسخة احتياطية لبيانات الصورة لتخزين آمن. قم بإلغاء مزج الصورة باستخدام نفس الإعدادات المحسنة التي تم تطبيقها أثناء اكتساب المناطق المبلطة.
التقاط صورة من كل تحكم ملون واحد للحصول على طيف الإشارة الحقيقي، ومن التحكم غير المصبوغ، لالتقاط الخلفية أو التوهج الذاتي. استخدم هذه الصور حصريا لفصل الخلط الطيفي. تأكد من أن المنطقة المختارة تمثل إشارة حقيقية من خلال التحقق من أن الشدة والشكل غائبان أو مكافئتان لمستويات الخلفية في الضابط غير المصبوغ، وأن تحديد المواقع للعلامات يطابق نمط خلويتها المتوقع مثل التوزيع الغشائي أو النووي أو السيتوبلازمي أو الإفرازات.
افتح صورة الsnap في البرنامج. انقر على تبويب فك المزج واختر إحدى أدوات اختيار المنطقة تحت تبويب أدوات غير المخلطة، ارسم منطقة اهتمام أو عائد حول الإشارة الإيجابية لتوليد طيف تلك المنطقة. قارن كل طيف مولد مع طيف الانبعاثات النظري للفلوروفور المقابل.
تأكد من أن المنطقة تمثل الإشارة الحقيقية بدقة. سم كل طيف حسب هوية الفلوروفور، واحفظه في قاعدة بيانات الطيف. بعد ذلك، قم بتحميل الصورة المبلطة وافتح أداة فك المزج.
استخدم زر الجمع لإضافة الطيف المرجعي لكل فلوروفور إلى قائمة فك الخلط. انقر على زر إلغاء الخلط الخطي لفصل الإشارات الطيفية وحفظ الصورة غير المختلطة. جهز محلول التبييض في غطاء بخار.
باستخدام ملعقة صغيرة، تزن 10 ملليغرام من بوروهيدريد الليثيوم مباشرة في كأس جاف. أضف بعناية 10 ملليلتر من الماء فائق النقي إلى الكأس وامزجه حتى يذوب المركب بالكامل. أضف حوالي 100 ميكرولتر من محلول التبييض الجاهز حديثا إلى كل قسم من الأنسجة باستخدام ماصة باستور زجاجية وحضن الشرائح في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة داخل غطاء البخار.
إذا مات اللون البنفسجي اللامع المبيض، انقل الشريحة بعناية إلى مجهر فوق فلوري واختر الفلتر الدابي. ركز العينة وأضيئها بكامل طاقتها. الآن استخدم هدفا 5X لتحقيق مجال إضاءة أكبر وخفض المسرح بالكامل لمنع أي ملامسة بين السلايد والهدف أو الهيكل.
وأخيرا، قم بتفريغ محلول الليثيوم بوروهيدريد من كل بئر باستخدام ماصة باستور زجاجية وأعدها إلى كأس محلول التبييض الأصلي. اغسل السلايدات ثلاث مرات باستخدام محلول تخفيف واحتضن لمدة تقارب ثلاث دقائق خلال كل غسل. أضف خليط الأجسام المضادة وصبغ العينة كما هو موضح سابقا.
في السلائل الأنفية غير المعالجة، أظهرت صبغة نسيج الورم مع CD3 وCD4 وCD20 تألق حبيبي غير محدد مكثف في المناطق الغنية باليوزينوفيل. بينما كانت الإشارة الموضعية الحقيقية للغشاء موجودة بشدة أقل. فشل المعالجة المبدئية بحليب خالي الدسم بنسبة 5٪ في حجب الفلورية غير النوعية تماما، كما قللت من شدة الإشارة للفلوروفور مثل AF 532.
قلل العلاج المسبقي من الداب، مما قلل من الفلورة غير المحددة من اليوم 20 واليوم الثالث والرابع، كما قلل من شدة الإشارة الحقيقية عبر قنوات متعددة بما في ذلك DAPI وAF 532. العلاج المسبق بالهيبارين أدى إلى منع الارتباط غير النوعي بفعالية مع الحفاظ على كثافة إشارة عالية ليوم CD3 و4 وCD20 وDAPI. حجب الهيبارين الإشارة غير المحددة بطريقة تعتمد على التركيز مع تحقيق كبت كامل عند 10 وحدات دون أي تأثيرات ضارة عند تركيزات أعلى.
نظام تصوير ثلاثي المسارات قلل من وقت الاكتساب، لكنه أدخل تداخل التوتر بما في ذلك تسرب AF 594 إلى قناة PE، وتعزيز التألق الذاتي للأنسجة بسبب الإثارة الليزرية المتعددة. التصوير الطيفي أزال تقريبا كل الخلفية والتداخل مع تقليل وقت الاكتساب وحسن نسبة الإشارة إلى الخلفية. كشف التصوير الطيفي لبوليب أنفي بشري عن هياكل ظهارية معلمة بواسطة EpCAM.
الخلايا المناعية مثل الخلايا اللمفاوية الموجبة CD3 وCD20 الإيجابية، والأوعية التي تعبر عن CD31 وCD34. أدى علاج الهيبارين إلى القضاء على ارتباط الحبيبات دون تقليل الإشارة، محافظا على كبت قوي في الخلفية عبر دورات IBEX. يقلل الفصل الطيفي من التسريب من الخلفية، ويزيد التألق الذاتي من الإشارة إلى الخلفية، ويسرع بشكل كبير عملية الاكتساب بين اللوحات المتعددة مقارنة بالكونفوكال متعدد المسارات.
يتيح ذلك البروتيوميات المكانية القوية والأنسجة الصعبة التي تدعم رسم خرائط دقيقة لحالة الخلية وتحليل مستوى الأحياء.
اعرض النص الكامل واحصل على الوصول إلى آلاف الفيديوهات العلمية
نظرة عامة
تعمل هذه الدراسة على تحسين سير عمل IBEX من خلال دمج حجب الهيبارين واكتشاف الطيف لتعزيز وضوح الإشارة في الأنسجة البشرية الغنية بالـ eosinophil. يهدف هذا النهج إلى قمع التألق الذاتي والربط غير المحدد، مما يسهل تحليلات البروتيوميات المكانية عالية المعلمات.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلم
- علم الأعصاب
- علم الأحياء
- علم البروتيوميات
الخلفية
- تم تصميم تقنية IBEX لتصوير عالي المعلمات.
- حجب الهيبارين يقلل من الربط غير المحدد.
- يمكن أن يحجب التألق الذاتي الإشارات الحقيقية في التصوير.
- تحسين سير العمل ضروري لتحليلات البروتيوميات المكانية الدقيقة.
هدف الدراسة
- تعزيز تقنية IBEX للحصول على نتائج تصوير أوضح.
- لتقليل الضوضاء الخلفية في الأنسجة الغنية بالـ eosinophil.
- لتمكين تحليلات البروتيوميات المكانية متعددة الجولات بشكل متين.
الطرق المستخدمة
- حجب الهيبارين لتقليل الربط غير المحدد.
- الكشف الطيفي مع الإزالة الحسابية.
- إعداد عينات الأنسجة مع PBS لإعادة الترطيب.
- استخدام الحواجز الكارهة للماء لعزل عينات الأنسجة.
النتائج الرئيسية
- نجاح في قمع التألق الذاتي في التصوير.
- تحسن في وضوح الخرائط البروتيومية المكانية عالية المعلمات.
- تسارع عمليات الحصول على الصور.
- تثبت متانة سير عمل IBEX الأمثل.
الاستنتاجات
- تعمل تقنية IBEX المحسنة على تعزيز جودة التصوير بشكل كبير.
- حجب الهيبارين فعال في تقليل الربط غير المحدد.
- تحسن طرق الكشف الطيفي من دقة تحليلات البروتيوميات.
الأسئلة المتداولة
Executive Industry Relevance
High-plex spectral confocal imaging with IBEX enables robust spatial proteomics in tissue environments where autofluorescence and non-specific staining have previously limited data quality. By integrating heparin blocking and spectral unmixing, this workflow delivers high-dimensional, single-cell resolution maps critical for target validation and mechanistic de-risking in complex human tissues. The approach accelerates early discovery and supports confident advancement decisions in translational and preclinical research pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables precise mapping of cell clusters and their microenvironments for functional target validation.
- Reduces biological ambiguity by distinguishing true marker expression from background fluorescence.
- Supports mechanistic de-risking through high-content, spatially resolved proteomic data.
- Facilitates portfolio triage by providing robust evidence of target engagement in native tissue contexts.
Screening & Assay Development
- Prepares validated tissue systems for downstream multiplexed imaging workflows.
- Standardizes assay conditions to minimize bleed-through and non-specific signal.
- Delivers reproducible, quantitative outputs suitable for high-throughput screening platforms.
- Enables reliable evaluation of compound effects on diverse cell populations within intact tissue.
Translational & Preclinical Research
- Aligns spatial proteomic readouts with disease-relevant tissue models for translational continuity.
- Supports biomarker discovery and validation in challenging, autofluorescent tissues.
- Provides risk-adjusted data for preclinical advancement decisions.
- Enhances predictive confidence in tissue-level pharmacodynamics and mechanism-of-action studies.
Pipeline & Workflow Integration
This optimized spectral IBEX workflow bridges early discovery, lead identification, and preclinical research by enabling high-content, spatially resolved analysis in complex tissue systems.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by resolving true marker localization at single-cell resolution.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative imaging outputs for assay readiness and compound evaluation.
- Analytics: Provides high-dimensional, spatially resolved proteomic data for robust statistical comparison across experimental conditions.
- Translational Research: Maintains continuity from discovery through preclinical validation in disease-relevant tissue models.
- Enterprise Reuse: Establishes a broadly applicable imaging capability for diverse tissue types and research programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in tissue-based studies.
- Operational Value: Standardizes imaging workflows, improves reproducibility, and accelerates acquisition time.
- Strategic Value: Enables better go/no-go decisions and reduces late-stage biological risk through robust spatial data.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of discovery and translational programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in spectral confocal microscopy and computational unmixing.
- Needs access to advanced imaging instrumentation and secure data storage infrastructure.
- Demands cross-team standardization of staining, imaging, and analysis protocols.
- Adaptation may be necessary for tissues with unique autofluorescence or binding properties.
- Practical limitations include the need for validated controls and careful optimization of blocking and acquisition parameters.
![تصوير الأنسجة اميلويد ملطخة بالانارة أوليجوثيوفينيس مترافق بالفائقة الطيفية [كنفوكل] مجهرية والأسفار تصوير مدى الحياة](/_next/image?url=https%3A%2F%2Fcloudfront.jove.com%2FCDNSource%2Fteasers%2F56279.jpg%3Fv%3D2026-08-11T08%253A27%253A19.245Z&w=384&q=75)
![[كنفوكل] مجهرية يكشف خلية مستقبلات سطح التجميع عن طريق التحليل الطيفي ارتباط الصورة](/_next/image?url=https%3A%2F%2Fcloudfront.jove.com%2FCDNSource%2Fteasers%2F57164.jpg%3Fv%3D2026-08-11T08%253A27%253A19.639Z&w=384&q=75)
