التطورات في التنميط الأيضي لكرويات أورام الدماغ ثلاثية الأبعاد لفحص الأدوية

يهدف البحث إلى تحسين تكوين جذر الخلايا ثلاثية الأبعاد لدراسة استقلاب الطاقة باستخدام تقنية Seahorse ، مع التركيز على النشاط الأيضي السلوكي للخلية والاستجابات الدوائية في نموذجنا ذي الصلة سريريا. ستعزز هذه النتائج نماذج صب الأدوية من خلال توفير تمثيل أكثر دقة لأورام المخ ، وتحسين تقييم العلاج ، وتحليل التمثيل الغذائي لاستراتيجيات علاج أفضل. مهدت النتائج الطريق للتحقيق في كيفية تغير استقلاب الطاقة في النماذج الكروية ثلاثية الأبعاد ، وكيف تخرج الأدوية من تأثيرات على مسارات التمثيل الغذائي ، والآليات التي تساهم بها التغيرات الأيضية في تطوير مقاومة الورم للعلاج.

بعد إعادة تعليق خلايا U87 التي تم جمعها في DMEM ، قم بتسخين الوسط غير المستخدم مسبقا إلى 37 درجة مئوية. حافظ على معلقات الخلية في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة. بناء على عدد الخلايا الأولي ، قم بتخفيف تعليق الخلية باستخدام DMEM الذي يحتوي على 10٪ FBS إلى حجم نهائي يبلغ 20 ملليلترا ، مما يضمن ما يقرب من 200،000 خلية.

امزج تعليق الخلية النهائي جيدا عن طريق الانعكاس المتكرر. أضف ببطء 200 ميكرولتر من التعليق على طول حافة كل بئر في لوحة 96 بئرا مستديرة شفافة ذات صلة منخفضة للغاية ، ثم أغلق اللوحة بإحكام باستخدام Parafilm لمنع التسرب أثناء الطرد المركزي. ضع اللوحة محكمة الغلق في جهاز الطرد المركزي وقم بتشغيلها عند 200 جم لمدة دقيقتين لحبيبات الخلايا في قاع كل بئر.

قم بإزالة اللوحة من جهاز الطرد المركزي. قم بإزالة البارافيلم بعناية ، وضع الطبق في حاضنة 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون. لتحضير محلول طلاء ، قم بإذابة خمسة ملليغرام من Poly-D-Lysine في 50 مل من الماء المعقم ، واخلط المحلول جيدا حتى يذوب تماما.

أضف 30 ميكرولتر من محلول الطلاء إلى كل بئر من لوحة الفحص الأيضي. تأكد من عدم وجود فقاعات عن طريق هز اللوحة برفق أو شفط المحلول الزائد. احتضن الطبق مع الغطاء لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة ، ثم استنشق محلول الطلاء ، واغسل الآبار مرتين ب 200 ميكرولتر من الماء المعقم.

جفف الطبق في الهواء لمدة 30 دقيقة على الأقل ، ثم سخني الطبق على حرارة 37 درجة مئوية بدون ثاني أكسيد الكربون لمدة 30 دقيقة لتثبيت الطلاء. بعد ذلك ، أضف 175 ميكرولتر من الوسط المسخن مسبقا إلى كل بئر. احتفظ باللوحة عند 37 درجة مئوية في حاضنة خالية من ثاني أكسيد الكربون ، حتى تصبح جاهزة لنقل كروية الخلية.

انقل الصفائح الكروية إلى نظام تصوير عالي المحتوى بعد خمسة أيام من الاستزراع. لتكوين معلمات التصوير، اضبط درجة الحرارة على 37 درجة مئوية ومستوى ثاني أكسيد الكربون على 5٪. اضبط نوع اللوحة والقنوات ونطاق التركيز على إعدادات النظام. بعد ذلك ، احصل على صور كروية باستخدام مجهر متحد البؤر بأهداف 10 أضعاف وبرنامج التصوير ، ثم حدد الآبار التي تحتوي على كروية سليمة ، وسجل مواقعها للنقل.

قم بتعيين الكروية السليمة لمجموعتين ، مجموعة تحكم مع ستة آبار مكررة ومجموعة معالجة مع ستة آبار مكررة لمعالجة الفينوفيبرات. تحضير محلول عمل fenofibrate في وسط دافئ طازج بالتركيز الأمثل. قم بإزالة الكروية التي تحتوي على لوحة منخفضة التعلق بعناية من نظام التصوير وضعها على سطح معقم داخل خزانة السلامة البيولوجية.

ضع لوحة الفحص المطلية بالبولي دي ليسين بجوارها للنقل، ثم قم بقص طرف ماصة سعة 20 ميكرولتر للسماح بالشفط اللطيف للكروية الخلوية دون التسبب في تلف. باستخدام طرف الماصة المشذب ، استنشق كل كروي سليم برفق من قاع بئره. انقل كل كروي إلى البئر المقابل للوحة المطلية ، واتركه يستقر لمدة 20 ثانية.

انقل لوحات الفحص الكروية ثلاثية الأبعاد إلى نظام تصوير عالي المحتوى. لتحليل البيانات المورفولوجية ، قم بتطبيق وحدة منطقة النسيج لفصل الكرويات ثلاثية الأبعاد بشكل خشن عن الخلفية عن طريق تقسيم محتوى الصورة إلى ثلاث مجموعات بناء على ميزات النسيج. قم بتطبيق وحدة منطقة البحث عن الصورة لتحسين فصل الكرويات ثلاثية الأبعاد المعزولة مسبقا باستخدام خصائص الحجم المستندة إلى الحجم ، مما يضمن إزالة الشوائب والاحتفاظ بالكروية السليمة.

قياس المعلمات المورفولوجية للكروية ثلاثية الأبعاد باستخدام وحدة خصائص المورفولوجيا. قم بتطبيق الوحدة النمطية للسكان المحددة لتصفية كروية الخلايا ثلاثية الأبعاد الأصلية والاحتفاظ بها فقط، ثم تصدير نتائج البيانات المورفولوجية. تشكلت الكروية بشكل واضح بحلول اليوم الخامس من الثقافة ، مع الحفاظ على مورفولوجيا كروية موحدة عبر جميع العينات المرصودة.

كما لوحظ وجود كروي متفكك مع سلامة هيكلية معطلة بشكل واضح في اليوم الخامس. كشف تحليل ما بعد النقل أن كلا من الكرويات ثلاثية الأبعاد المعالجة بالفينوفيبرات والتحكم ظلت سليمة في معظم الحالات ، لكن بعض الكرويات المعالجة بالفينوفيبرات قد تفككت. انخفض معدل استهلاك الأكسجين بشكل ملحوظ في الكرويات المعالجة بالفينوفيبرات عبر جميع النقاط الزمنية مقارنة بالمجموعة الضابطة.