نمذجة مرض الميتوكوندريا باستخدام عضيات الدماغ: التركيز على اعتلال عضلة الدماغ في الميتوكوندريا ، والحماض اللبني ، والنوبات الشبيهة بالسكتة الدماغية

نطاق بحثنا هو فهم مقاييس أمراض الميتوكوندريا وإيجاد أدوية لعلاجها. التحدي هو الحفاظ على القدرة على إجراء اختبارات عالية الإنتاجية، حتى وإن كانت التقنية تحتوي على تكوين عضوي. للبدء، قم بإزالة الوسط من ألواح زراعة الخلايا الجذعية متعددة القدرات المستحثة عندما تكون حوالي 70 إلى 80٪ من التلاقط.

اغسل الخلايا ب PBS. أضف 350 ميكرولتر من محلول الإنزيم إلى الخلايا وحضنها. أضف 800 ميكرولتر من وسط تثبيت الساق لإيقاف التفاعل.

بعد نقل نظام التعليق الخلوي إلى أنبوب جديد، قم بعمل الطرد المركزي عليه عند 190 جرام لمدة خمس دقائق عند 22 درجة مئوية. بعد ذلك، أعد تعليق الحبيبة في ملليلتر واحد من وسط التمايز. بعد عد الخلايا، قم بزرع 3000 خلية في 100 ميكرولتر في كل بئر من صفيحة على شكل U بحجم 96 بئر منخفضة التماسك.

حضن لمدة ستة أيام عند درجة حرارة 37 درجة مئوية، مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون. بعد الحضانة، استخدم ماصة واسعة القطر لنقل الأعضاء من صفيحة البئر 96 إلى طبق بحجم 10 سنتيمترات. بيبت 50 ميكرولتر من DMEM/F12 المتوسط المكملة لكل بئر من صفيحة جديدة بسعة 96 بئر.

اجمع الأعضاء في أنبوبين بحجم مليليتر. أزل الوسط بعناية دون استنشاق الأعضاء العضوية، وأضف 1.5 ملليلتر من الوسط المضاف DMEM/F12. بعد إزالة آخر غسلة، أضف 500 ميكرولتر من الوسط الطازج.

ثم انقل الأورجينويدات إلى طبق بحجم 10 سنتيمترات. أضف خمسة ملليلتر من الوسط لتسهيل اختيار كل عضو عضوي. انقل جميع الأعضاء العضوية إلى كل بئر في صفيحة بحجم 96 بئر باستخدام ماصة دقيقة مضبوطة على 50 ميكرولتر، وحضن لمدة ثلاثة أيام.

في اليوم التاسع، اجمع الأعضاء في أنبوبين بحجم مليليتر واغسله ثلاث مرات باستخدام DMEM/F12. ثم أعد تعليق الأعضاء في وسط التمايز. انقل حوالي 10 أورغانويدات في كل بئر إلى صفيحة بستة آبار وضبط الحجم النهائي للوسط في كل بئر إلى اثنين ملليلتر.

قم بزراعة الصفيحة بشكل ثابت لمدة ستة أيام عند درجة حرارة 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون. في اليوم الخامس عشر، اجمع الأعضاء في أنابيب بسعة 15 ملليتر. بعد ترك الأنابيب تستقر، أضف وسط تمايز جديد مكمل ب B27 وفيتامين A بعد إخراج السوبرناتانت.

انقل حوالي 10 أورجينويدات لكل بئر إلى صفيحة ذات ستة آبار. قم بزراعة العضوي بشكل ثابت لمدة 15 يوما عند درجة حرارة 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون. غطي صفائح الزراعة بمحلول بولي-إل-أورنيثين المخفف.

حضن الصحون طوال الليل عند درجة حرارة 37 درجة مئوية. في اليوم التالي، اغسل الآبار ثلاث مرات لمدة خمس دقائق لكل منها باستخدام PBS. الآن أضف محلول اللامينين المخفف إلى الآبار.

حضن الصحون لمدة ثلاث ساعات عند درجة حرارة 37 درجة مئوية، أو طوال الليل. قم بجهاز الطرد المركزي لنظام التعليق العضوي على حرارة 200G لمدة خمس دقائق. أزل السوبرناتينت وأضف ملليتر واحد من محلول الإنزيم.

اخلط جيدا وحضن على حرارة 37 درجة مئوية لمدة خمس دقائق قبل الطرد المركزي. بعد إزالة المادة الفائقة وإضافة ملليلتر واحد من محلول التشتت، ضع محلول العزل بعناية تحت التعليق. ثم قم بعمل نظام التعليق المركزي على حرارة 200G لمدة خمس دقائق.

الآن، قم بإخراج ماصة واحدة من الوسط العصبي إلى الأنبوب. اخلط المحلول ومرر التعليق عبر مصفاة 70 ميكرومتر إلى أنبوب 50 ملليتر. بعد عد الخلايا، قم بزرع تعليق الخلية بكثافة 100,000 خلية لكل سنتيمتر مربع على ألواح مطلية بالبولي-إل-أورنيثين ولامينين.

استبدل الوسيط كل أربعة إلى سبعة أيام حتى اليوم 60. لتثبيت العضوية لفحص التألق المناعي، قم أولا بجمع العضويات في أنابيب دقيقة. اشطف الأعضاء ب PBS، ثم ثبتها في 4٪ بارافورمالديهايد لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.

بعد التثبيت، اغسل الأعضاء المثبتة ثلاث مرات باستخدام PBS. تخزين الأورجينويدات عند أربع درجات مئوية حتى يتم استخدامها. بعد 30 يوما من البذر لزراعة الخلايا العصبية ثنائية الأبعاد، قم بإزالة وسط الزراعة من الصفائح.

ثم اغسل الخلايا ب PBS. ثبت الخلايا ب 4٪ بارافورمالديهايد لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. قم بإزالة البارافورمالديهايد، ثم غسل الخلايا ب PBS ثلاث مرات.

خزن الخلايا الثابتة عند أربع درجات مئوية حتى يتم استخدامها. لجمع الأعضاء لجهاز RTQPCR، انقلها إلى أنابيب دقيقة. تقوم بعمل PBS في الأنابيب لغسل الأعضاء العضوية.

الآن، أضف 350 ميكرولتر من محلول التحلل إلى الأعضاء العضوية، ثم جمدها في النيتروجين السائل. خزن الأنابيب عند ناقص 80 درجة مئوية حتى يتم استخدامها. تم تحفيز الخلايا العضوية الدماغية التي تحتوي على خلايا عصبية إيجابية ل FOXG1 بنجاح من خط IPSC 414C2 الضابط الصحي في اليوم 30، وتم الحصول على شبكات عصبية مزروعة ثنائية الأبعاد في اليوم 60.

تم تأكيد مستويات الهتروبلازم لمتغير M.3243A إلى G بواسطة QPCR. كان الخطوط من الثاني إلى الثامن معرضين لانخفاض التغاير اللازم، والخطوط من الثاني إلى السادس كان لديهم تغاير عالي. أظهرت عضويات الدماغ المشتقة من خط الهيتروبلازما المنخفض من اثنين إلى ثمانية أحجاما وأشكال مشابهة لتلك الموجودة لدى الضابطين الأصحاء.

أظهرت العضويات الناتجة من خط الهيتروبلازم العالي من الثاني إلى ستة حجما أقل بمقدار 0.3 مليمتر مربع، وشكل غير منتظم بقيمة دائرية 0.82. كانت معظم الخلايا العصبية المستحثة من خط 414C2 والخط من الخطين من اثنين إلى ثمانية إيجابية لفيروس FOXG1 في اليومين 30 و60. نادرا ما تم اكتشاف الخلايا العصبية الموجبة ل FOXG1 في العضويات أو الخلايا العصبية المزروعة ثنائية الأبعاد المشتقة من الخطين إلى الستة.

تشير نتائجنا إلى أن نماذج العضوية المستمدة من IPSC تمثل منصة مفيدة لدراسة المرايا والآليات وفحص المخدرات. طرقنا التقليدية ذات وقت الزراعة القصير وفعالية التكلفة توفر أدوات عملية للتحقيق في الفيزيولوجيا المرضية ل MELIS. نود البحث عن أدوية محتملة ل MELIS باستخدام مركبات يتم تسليمها للمرضى بشكل منظم في المستقبل.