توصيف إفراز الحويصلة خارج الخلوية المستخرج من الخلايا الدهنية باستخدام نموذج فأر CD63-GFP في الجسم الحي وفي المختبر

ندرس الحويصلات خارج الخلية المشتقة من الخلايا الدهنية، EVs، لتحديد أدوارها في الأنسجة الدهنية، وخاصة كيفية تنظيمها للتداخل بين الخلايا الدهنية الناضجة وخلاياها السابقة. لا توجد حاليا أنظمة داخل الجسم لدراسة إفرازات الخلايا الدهنية EV، كما أن بروتوكولات التنقية الحالية لم تحسم بالكامل بعد. للبدء، استخدم تقنية التعقيم لاستئصال الأنسجة الدهنية الإربية من الفئران المروحة.

ضع جرامة واحدة من النسيج في أنبوب بسعة ملليلتر يحتوي على 0.5 ملليلتر من حاجز الهضم. باستخدام مقص معقم، قم بتقطيع النسيج إلى قطع لا يزيد حجمها عن مليمتر واحد. الأنسجة المفروم في 10 ملليتر من محلول هضم يحتوي على 0.5 ملليغرام لكل ملليلتر ليبيراز و50 وحدة لكل ملليلتر DNase I. حضن العينة عند 37 درجة مئوية على هزاز مداري.

أثناء الحضانة، قلب الأنبوب بلطف عدة مرات. عندما يبدو المحلول عكما ولا تبقى شظايا نسيجية مرئية، يكتمل الهضم. لعزل الجزء الوعائي البترومي أو SVF، يتم تخفيف التعليق المهضوم باستخدام حجمين من حاجز الهضم.

اقلب الأنبوب بلطف ثلاث إلى أربع مرات لخلط الخليط جيدا. مرر التعليق عبر فلتر معقم بحجم 100 ميكرومتر لإزالة الأنسجة غير المهضومة، ثم قم بالطرد المركزي بالترشيح عند 300 جرام لمدة خمس دقائق عند أربع درجات مئوية. ضع علامة على الحبيبة ك SVF.

حضن الجزء الوعائي النسمي في محلول تحلل خلايا الدم الحمراء المحضر حديثا على الثلج لمدة خمس دقائق، محميا من الضوء. أضف مجلدين من محلول الغسيل والطرد المركزي عند 400 جرام لمدة خمس دقائق عند أربع درجات مئوية. أعد تعليق الجزء الوعائي النسجي في 80 ميكرولتر من المحلول المؤقت لكل جرام من النسيج وانقل المحتويات إلى أنبوب جديد.

أضف 20 ميكرولتر من كوكتيل استنزاف الخلايا غير الدهنية لكل جرام من الأنسجة. حضن العينة لمدة 15 دقيقة عند درجة حرارة تتراوح بين درجتين إلى ثماني درجات مئوية في الظلام. مرر العينة عبر عمود LS واجمع التدفق الذي يحتوي على جزء الخلية السالب في النسب.

قم بالطرد المركزي للتدفق عند 300 جرام لمدة خمس دقائق عند أربع درجات مئوية للحصول على الخلايا السلفية للخلايا الدهنية. حضن 250 ميكرولتر من خلايا الخلايا الدهنية المعزولة للفئران على شرائح حجرة ثمانية مغلفة بالكولاجين لمدة ست ساعات. ثبت الخلايا ب 4٪ بارافورمالديهيد لمدة 10 دقائق للحفاظ على هياكل الحويصلات الخلوية وخارج الخلية للتصوير.

بعد ذلك، اغسل الشرائح ثلاث مرات باستخدام PBS، ثم ثبتها بوسط مضاد للتلاشي. بعد عد الخلايا السلفية للخلايا الدهنية، قم بتعليقها وتخفيف صبغة القابلية للحياة. احتضنه على الثلج لمدة 20 دقيقة، محميا من الضوء.

اغسل الخلايا مرة واحدة باستخدام مخزن الغسيل وجهاز الطرد المركزي. الخلايا في محلول تلوين رائع بحيث يكون التركيز النهائي مليون خلية لكل 100 ميكرولتر. امنع الارتباط غير النوعي بإضافة مادة حجب مستقبلات Fc بنسبة واحد إلى 100 ثم حضن.

قم بتدوير الجسم المضاد SCA-1 بحرارة 6000 جرام لمدة 10 دقائق عند أربع درجات مئوية. أضف الجسم المضاد SCA-1 إلى أنبوب APC بدرجة تخفيف من واحد إلى 100، ثم ضع الأنبوب على الثلج محميا من الضوء. اغسل الخلايا مرتين باستخدام ملليلتر واحد من مخزن الغسيل، ثم قم بالطرد المركزي بحرارة 300 جرام لمدة خمس دقائق عند أربع درجات مئوية.

الخلايا في مخزن الغسيل لفرز التدفق الخلوي، ثم جمع بيانات الخلايا الموجبة SCA-1 وGFP الإيجابية على جهاز قياس تدفق طيفي مزود بليزر بنفسجي وأزرق. لبدء التمايز، غط الصحون بطبقة جيلاتين 0.2٪ لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. بذور ناقلات APC معزولة حديثا في وسط DMEM/F12 المكملة واحتضنها حتى التقاء.

استبدل الوسط من اليوم الأول إلى اليوم الثامن بوسط تمايز أديبوجيني MesenCult. في اليوم التاسع، اغسل الخلايا الدهنية مرتين ب PBS، ثم استبدل الوسط بوسط زراعة الخلايا الدهنية الناضجة يحتوي على DMEM 1٪ BSA و0.2٪ بريموسين. لعزل الحويصلات خارج الخلايا التي تفرزها الخلايا الدهنية، قم أولا بتمرير 15 ملليلتر من وسط الزراعة عبر فلتر بحجم 40 ميكرومتر، يليه مرشح بحجم 30 ميكرومتر.

قم بطرد المركزي على الترشيح عند 500 جرام لمدة خمس دقائق ثم قم بطرد المركزي بالمادة الفائقة على 2000 جرام لمدة 10 دقائق لإزالة أي خلايا أو بقايا متبقية. بعد تمرير المادة الفائقة الناتجة عبر فلتر بحجم 0.8 ميكرومتر ونقل المرشح إلى وحدة ترشيح فائقة بسعة 15 ملليتر، يقوم بالطرد المركزي بحرارة 4000 جرام لمدة 15 دقيقة لتركيز الوسط. قم بتحميل العينة المركزة على عمود كروماتوغرافيا استبعاد الحجم متصل بجامع الكسور الأوتوماتيكي وجمع الكسور من F1 إلى F8.To إجراء تحليل البقع الغربية، وتركيز كل جزء من 400 ميكرولتر إلى 25 ميكرولتر.

بيبيت 50 ميكرولتر من مخزن اختبار التكرار المناعي الإشعاعي مع مثبطات للبروتياز والفوسفاتاز إلى المركز. أضف 75 ميكرولتر من اثنين من محلول تحميل 2X SDS لإزالة طبيعة العينة وحل البروتينات على جل تريس-جليسين بنسبة 4٪ إلى 12٪. لتحليل تتبع الجسيمات النانوية، قم بتخفيف عينات الحويصلات خارج الخلية باستخدام PBS معقمة مفلترة بقياس 0.1 ميكرومتر وامزج بلطف.

تحميل العينة المخففة في جهاز NTA المزود بكاميرا أشباه موصلات أكسيد المعادن المكملة ذات الحساسية العلمية عالية الحساسية وليزر أخضر بقطر 532 نانومتر. اضبط الكشف عن الجسيمات بين 10 نانومتر و1,000 نانومتر، وضمن تركيز 10 إلى قوة من 6 إلى 10 إلى قوة تسعة جسيمات لكل ملليلتر. الخلايا السلفية الدهنية من فئران التوقف-القطيع-القطيع/CD63GFP لم تظهر أي بروتينات فلورية خضراء قابلة للكشف تحت المجهر الكونفوكلي.

بينما أظهرت خلايا فئران AdipCD63 العديد من البروتينات الفلورية الخضراء المميزة في جميع أنحاء السيتوبلازم. أظهر تحليل التدفق الخلوي أن 1.2٪ من خلايا الجمجمة 1 الإيجابية في فئران المراسلين عبرت عن بروتين فلوري أخضر مقارنة ب 12.6٪ في فئران AdipCD63-GFP. أظهر التلوين الغربي لكسور الكروماتوغرافيا الاستبعادية للحجم أن علامات الحويصلات خارج الخلية CD63 وHSP70 تم إثراؤها في الأجزاء F1 و F2. بينما كانت علامات الشبكة الإندوبلازمية والميتوكوندريا غائبة، مما يؤكد نقاء الحويصل.

كشف تحليل تتبع الجسيمات النانوية أن الحويصلات خارج الخلايا المشتقة من الخلايا الدهنية تتراوح حجمها بين 50 نانومتر و500 نانومتر، وأكد المجهر الإلكتروني الناقل أن الحويصلات تظهر هياكل غشائية مزدوجة سليمة. أكد البقعة الغربية خروج STX4 في الخلايا الدهنية. أظهر المجهر الكونفوكي أن الحويصلات الموجبة ل CD63-GFP كانت منتشرة في السيتوسول في الخلايا الدهنية البرية، لكنها تراكمت بالقرب من غشاء البلازما في الخلايا الدهنية المدمرة من STX4.

انخفض تركيز الحويصلات خارج الخلية المشتقة من الخلايا الدهنية المفرزة بشكل ملحوظ في الخلايا الدهنية المخرجة من STX4 مقارنة بالنوع البري. أظهر البقعة الغربية لكميات متساوية من البروتين في الحويصلات داخل الخلية انخفاضا في تعبير CD63 وCD81 في الخلايا الدهنية المجهزة في STX4 مقارنة بالنوع البري. يوفر البروتوكول نظاما قويا وقابلا للتكرار لدراسة إفراز الخلايا الكهربائية الدهنية في الجسم الحي والمختبي، بالإضافة إلى طريقة محسنة لتنقية الخلايا الدهنية للخلايا الدهنية.

يصف البروتوكول لأول مرة ويؤكد استخدام الطرد المركزي المتسلسلة منخفضة السرعة مع كروماتوغرافيا استبعاد الحجم لتنقية الخلايا الكهربائية المشتقة من الخلايا الدهنية الناضجة. تتيح لنا نتائجنا طرح أسئلة جديدة حول كيفية استخدام الخلايا الدهنية للحويصلات خارج الخلية للتواصل مع أنواع الخلايا الأخرى في ظروف فسيولوجية ومرضية.