التصوير الطيفي فائق الدقة لجزيئات الحمض النووي باستخدام التباين الذاتي

تقدم أبحاثنا أول بروتوكول لقياس الأطياف الفلورية الجوهرية لجزيئات الحمض النووي، مما يمكن من دراسة خصائصها البصرية الأصلية وخصائصها المرتبطة بتأكيد التسلسل. يستغل هذا البروتوكول الفلورة الداخلية للتصوير الطيفي للحمض النووي، متجنبا الاضطرابات الناتجة عن الوسم، وخطأ الربط، وكثافة الوسم غير المتسقة في الطرق الحالية. للبدء، قم بإذابة عينة الحمض النووي في ماء منزوع الأيونات خالي من النوكلياز، إلى تركيز نهائي يبلغ 100 ملي مولر.

حضر خمسة ميكرولتر من محلول مخزون الحمض النووي لتقليل تكرار دورات التجميد والذوبان. خزن الأنابيب الإضافية التي تحتوي على محلول المخزون عند 4 درجات مئوية. باستخدام مناديل مختبرية، نظف شريحة زجاجية بلطف.

ضع خمسة ميكرولترات من محلول الحمض النووي بوزن 100 مللي مولر على شريحة زجاجية نظيفة حديثا واترك العينة تجف لمدة ساعة إلى ثلاث ساعات لتكوين جل الحمض النووي. في غطاء البخار، جهز إما مخزن بيتا-ميركابتوإيثانول أو مخزن تصوير DABCO لدعم التبديل الضوئي العشوائي لجزيئات الحمض النووي. قم بوضع خمسة ميكرولتر من مخزن التصوير على جل الحمض النووي وضع غطاء فوق العينة.

إذا كانت هناك فقاعات داخل العينة المغطاة، استخدم ملقطا لإزالتها. احصل على مصفوفة نانوية مصنعة تحتوي على فتحات قطرها 100 نانومتر، موزعة على بعد أربعة ميكرومترات، مرتبة في ثمانية صفوف وخمسة أعمدة. شغل نظام sSMLM وأدخل فلاتر ضيقة النطاق الترددي مباشرة أمام الكاميرا.

ضع عينة المعايرة تحت المجهر وشغل مصباح المجهر لإضاءة العينة. اضبط وقت التعريض إلى 200 مللي ثانية لجميع الفلاتر، لكن غيره إلى 2,000 مللي ثانية لفلتر 750 نانومتر. اذهب للحصول على تايم لابس سريع لضبط عدد الإطارات إلى 10 لكل فلتر.

بعد المعايرة، قم بتحميل عينة جل الحمض النووي على مرحلة المجهر بحيث يكون جانب الغطاء مواجها للهدف وافتح برنامج الكاميرا لجمع البيانات. حدد الموضع Z المناسب باستخدام نظام تتبع التركيز التلقائي وضبط التركيز حتى يظهر وميض عشوائي واضح. تأكد من أن الهدف لا يلامس حافة انزلاق الغطاء لمنع تسرب المخزن إلى زيت الغمر والتداخل مع التتبع.

احصل على حوالي 10,000 إلى 30,000 إطار بطاقة إضاءة مرغوبة وزمن تعريض يبلغ 30 مللي ثانية. بعد جمع البيانات، يسمح للبرنامج بحفظ البيانات بصيغة nd2 بشكل افتراضي. تخلص من شريحة الزجاج في سلة نفايات معتمدة مخصصة للزجاج المكسور أو الأشياء الحادة.

تخلص من جميع المخازن المتبقية في حاوية النفايات السائلة الكيميائية المخصصة وفقا لإرشادات السلامة المؤسسية. افتح فيجي واستخدم إضافة bio formats لتحميل مكدس الصور الخام المستحوذ على عينة الحمض النووي. اختر الصورة متبوعة بالمكدمات، وZ Project، واختر الحد الأدنى للشدة كنوع الإسقاط لتوليد الحد الأدنى للإسقاط لمكدس الصورة الخام.

اختر حاسبة الصورة واطرح الحد الأدنى للإسقاط من مكدس الصور الخام. احفظ مجموعة البيانات القابلة للخصم في الخلفية كملف TIF للتحليل الطيفي. بعد ذلك، قم بتحديد التوطين على مكدس الصور الخام من الدرجة الصفرية باستخدام إضافة ThunderSTORM الإصدار 1.3.

اضبط العتبة إلى 1.2 ضعف موجة الانحراف المعياري. F1، نصف قطر التركيب على ثلاثة، وسيغما إلى 1.5 لإعادة بناء صورة الرتبة الصفرية واستخراج إحداثيات حدث الانبعاث. بالنسبة لمجموعة الصور الخام المقصوصة من الدرجة الصفرية، اختر الإضافة تليها ThunderSTORM وقم بتشغيل التحليل.

استخدم فيجي وبرنامج RainbowSTORM مفتوح المصدر مع إصدار MATLAB أحدث من 2020b لمعالجة بيانات المعايرة والحصول على العلاقة بين الإزاحات الأفقية والعمودية والأطوال الموجية. قم بتحديد الموقع على صور المعايرة للأطوال الموجية الخمسة باستخدام إضافة ThunderSTORM. اضبط العتبة إلى خمسة أضعاف الانحراف المعياري، الموجة.

F1، مع تركيب نصف قطر على ثلاثة، وسيغما إلى 1.5 لإعادة بناء مواقع الحفر النانوية على الرتبة الصفرية والمواقع الطيفية المقابلة على الرتبة الأولى. احصل على صورة متوسطة لكل بيانات معايرة وضبط العتبة ضمن نطاق يتراوح بين خمسة إلى عشرة أضعاف موجة الانحراف المعياري. من F1 حتى 80 عملية تحديد موقعية لكل صورة معايرة.

شغل RainbowSTORM وانقر على تصفح تحت المعايرة الطيفية لتحميل ملفات CSV لكل طول موجة معايرة. ثم اضغط على حفظ ملف المعايرة لتخزين ملف المعايرة. استخدم نسخة 3.11.7 من سكريبت بايثون المخصص لاستخراج بيانات الطيف الكامل.

ثم قم بتعيين مسارات الملفات الصحيحة في سكريبت بايثون لمكدس الصور الطرحة في الخلفية بصيغة TIF من خطوة الطرح السابقة. قم بتعيين مسار الملف لملف CSV التوطين الناتج من خطوة تحليل التوطين وملف المعايرة بصيغة MAT الناتج عن خطوة المعايرة. ثم ضبط التحول الأفقي إلى 925 إلى 984 بكسل للبيانات التي يتم الحصول عليها بحجم 532 نانومتر باستخدام عرض توازي ثلاثي الأبعاد يتوافق مع نافذة طيفية من 525 إلى 750 نانومتر لضمان التغطية التي تتجاوز نطاق مرشح 590 إلى 650 نانومتر.

قم بضبط التحول الرأسي إلى 23 بكسل لكل من بيانات 488 نانومتر و532 نانومتر التي تم الحصول عليها باستخدام DWP ثلاثي الأبعاد بناء على منحنى المعايرة الطيفية المأخوذ باستخدام RainbowSTORM. وأخيرا، خطي الطيف غير الخطي باستخدام ملاءمة كثير حدود من الدرجة الثالثة لتحليل المقارنة والتصنيف لاحقا. تم إجراء معايرة طيفية، مما مكن من قياس الإزاحات الأفقية والعمودية المقابلة بين الصور من الدرجة الصفرية والصورة من الدرجة الأولى.

سمح ذلك بتعيين منحنى معايرة بين موضع البكسل والطول الموجي. تم الحصول على أطياف الانبعاث الخطية غير الخطية والمحولة تحت إثارة 532 نانومتر ل GC alter، والتي تشير إلى نوع من جزيئات الحمض النووي ذات السلسلتين السلسلتين. كان المنحنى الأخضر يمثل الطيف المتوسط.

تم الحصول على أطياف الانبعاث الخطية غير الخطية والمحولة ل A10C10، وهو نوع من جزيئات الحمض النووي أحادي السلسلة، تحت إثارة 488 نانومتر، حيث يمثل المنحنى الأزرق الطيف المتوسط. يتيح هذا البروتوكول للباحثين قياس أطياف الفلورية الجوهرية لجزيئات الحمض النووي أحادية ومزدوجة السلسلة مصنعة باستخدام التصوير فائق الدقة الطيفية. تحديد الموقع الدقيق ل Z أمر بالغ الأهمية، حيث تفتقر عينات جل الحمض النووي إلى المعلومات الهيكلية وتتطلب تركيزا دقيقا لملاحظة الوميض العشوائي.

يمكن أن يمتد العمل المستقبلي لقياس التألق الداخلي للحمض النووي الريبي والبروتين، مع دمج النماذج الحسابية للتنبؤ بالتسلسل وتصوير الكروماتين الخالي من الملصقات.