في المختبر التحليل الوظيفي لخلايا التائية التنظيمية: التركيز على التكاثر والتمايز

درس مختبرنا تمايز المجموعات الفرعية للخلايا التائية، والتمثيل الغذائي، والتفاعل. يؤثر تريغ على تداخل الخلايا التائية، ويحافظ على توازن المناعة، مما يجعل أبحاث تريغ ضرورية لعلاج أمراض المناعة الذاتية والالتهابية. اختبارات تثبيط التريج التقليدية في المختبرات أغفلت التأثيرات التي يبوطها التريج وتمايز الخلايا التائية المؤثرة.

يقوم هذا البروتوكول المعدل بتقييم كل من الانتشار والاستقطاب في الوقت نفسه. للبدء، جهز خلايا T ساذجة، خلايا T أو Treg التنظيمية المعتمدة على T، وخلايا غير إيجابية CD4 غنية بالخلايا العرضة للمستضد. قم بطرد المركزي بتعليق خلايا T الإيجابية CD4 الساذجة عند 350 جرام لمدة سبع دقائق عند أربع درجات مئوية وتخلص من المادة الفائقة للحصول على حبيبات الخلية.

قم بتخفيف صبغة تكاثر الخلايا eFluor 450 في PBS للحصول على تركيز 20 ميكرومولار في درجة حرارة الغرفة. أضف 0.5 ملليلتر من PBS لكل واحد مضروبا في 10 إلى قوة سبع خلايا في الأنبوب. حافظ على إمالة الأنبوب بزاوية حوالي 45 درجة وأعد تعليق الخلايا بلطف عن طريق التوصيل للأعلى والأسفل 50 مرة.

بعد ذلك، أضف كمية متساوية من محلول صبغة تكاثر الخلايا بسرعة إلى تعليق الخلية للحصول على تركيز نهائي يبلغ 10 ميكرومولار. أمسك الأنبوب بزاوية 45 درجة وقم بعمل ماصة على الخلايا لخلطها جيدا مع صبغة تكاثر الخلايا. لف أنبوب الطرد المركزي فورا بورق الألمنيوم لتجنب التعرض للضوء.

حضنها في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة مع الدوران الخفيف كل خمس دقائق لمنع تجمع الخلايا. بعد ذلك، أضف 10 ملليلتر من وسط زراعة الخلايا المبرد مسبقا إلى أنبوب الطرد المركزي وقم بتدوير الخلايا بلطف لإنهاء التلوين. ثم تقوم بالطرد المركزي على الخلايا وتخلص من السوبرناتانت.

لغسل الخلايا، أضف خمسة ملليلتر من وسط زراعة الخلايا المبرد مسبقا إلى حبيبة الخلية. كرر عملية الطرد المركزي وأعد تعليق الحبيبة في وسط زراعة بسعة خمسة ملليتر. بعد عد الخلايا، يتم الطرد المركزي للخلايا وإعادة تعليقها في حجم مناسب من وسط الزراعة لتحقيق تركيز خلوي مرتين في عشرة لكل ملليلتر بقوة ست خلايا.

أبق الأنبوب على الثلج. احسب عدد العينات المطلوبة لزراعة الحيوانات. جهز كمية مناسبة من وسط زراعة الخلايا يحتوي على 2.5 ميكروغرام لكل ملليلتر من الأجسام المضادة CD3 المضادة للفئران أو السيتوكينات الحثية المناسبة.

خذ خلايا T الساذجة المحضرة والخلايا الغنية بالتريج وادمرها في دوامة. أضف 100 ميكرولتر من خلايا T إيجابية CD45.2، وخلايا T ساذجة إيجابية CD4، و100 ميكرولتر من خلايا CD45.1 الإيجابية غير الإيجابية CD4 الغنية ب APC إلى صفيحة 48 بئرا. نقل 100 ميكرولتر من الخلايا الغنية ب Treg إيجابي CD45.1، ومثبت CD4، ومثبت CD25 موجبة ب Treg إلى الآبار التجريبية و100 ميكرولتر من وسط زراعة الخلايا إلى آبار التحكم.

ثم تدمج 100 ميكرولتر من وسط الزراعة الذي يحتوي على الأجسام المضادة CD3 المضادة للفئران و100 ميكرولتر من وسط الزراعة الذي يحتوي على السيتوكينات الحثية المناسبة في كل بئر. أضف PBS إلى الآبار الفارغة المتبقية للحفاظ على رطوبة اللوحة وتقليل تأثيرات الحواف. حضن صفيحة ال 48 بئرا في حاضنة ثاني أكسيد الكربون بنسبة 5٪ عند درجة حرارة 37 درجة مئوية لمدة ثلاثة أيام.

قم بعمل ماصة برفق على الخلايا المزروعة لإعادة تعليقها ونقل تعليق الخلية إلى أنبوب طرد مركزي بسعة 1.5 ملليلتر. قم بعمل طرد مركزي للخلايا وإزالة المادة الفائقة. أضف 500 ميكرولتر من وسط زراعة الخلايا الذي يحتوي على فوربول 12-ميريستات 13-أسيتات، الأيونومايسين، ومثبط نقل البروتين جولجي بلاج إلى كل أنبوب.

قم بتدوير خفيف لإعادة تعليق الخلايا وحضانها في حاضنة ثاني أكسيد الكربون بنسبة 5٪ عند درجة حرارة 37 درجة مئوية لمدة ثلاث ساعات. بعد الطرد المركزي، أضف 50 ميكرولتر من PBS يحتوي على اختبار واحد من صبغة الأصفر الزومبي وأجسام مضادة مضادة مخففة مضادة للفئران CD16 أو 32 إلى الحبيبة. قم بعمل دوامة للعينات وحضن العينات في درجة حرارة الغرفة في الظلام لمدة 15 دقيقة لوضع علامات على الخلايا الميتة وحجب مستقبلات ال FC.

قم بعمل الطرد المركزي على الخلايا قبل التخلص من السوبرناتانت. أضف 50 ميكرولتر من كوكتيل الأجسام المضادة السطحية إلى العينة، ثم قم بدورانها، وحضن المحلول عند أربع درجات مئوية في الظلام لمدة 20 دقيقة. ثم أضف ملليتر واحد من فرز الخلايا المنشط بالفلورية أو مخزن FACS لكل أنبوب طرد مركزي.

بعد الطرد المركزي وإزالة المادة الفائقة، أضف 300 ميكرولتر من محلول التثبيت والنفاذية إلى كل أنبوب طرد مركزي وتدوير العينات. حضن العينات عند أربع درجات مئوية في الظلام لمدة 20 دقيقة. نقل على ملليلتر من النفاذية ومخزن الغسيل إلى كل أنبوب طرد مركزي، تليها الطرد المركزي وإزالة المادة الفائقة.

بعد تكرار الغسيل، أضف 50 ميكرولتر من كوكتيل الأجسام المضادة للسيتوكين إلى كل عينة وقم بتدوير العينات. حضن العينات عند أربع درجات مئوية في الظلام لمدة 40 دقيقة. اغسل كل عينة بملليتر واحد من النفاذية وغسل المخزون.

قم بعمل طرد مركزي للخلايا وإزالة المادة الفائقة. أعد تعليق حبيبات الخلية في 300 ميكرولتر من مخزن FACS. قياس تكاثر وتمايز خلايا T المستجيبة باستخدام قياس خلوية التدفق.

تداخل مجموعة الخلايا اللمفاوية بين الخلايا الكلية لاستبعاد الحطام والشوائب الخلوية. اختر مجموعة الخلايا المفردة بين الخلايا اللمفاوية بناء على إشارات التشتت. ثم يتم تحديد مجموعة الخلايا الحية بين الخلايا المفردة، تليها مجموعة الخلايا التائية الموجبة CD4 بين الخلايا الحية.

بعد ذلك، تفرق بين مجموعة الخلايا التائية الإيجابية التنظيمية CD45.1 ومجموعة الخلايا التائية الإيجابية CD45.2 بين الخلايا التائية الإيجابية CD4. ثم اختر خلايا T مساعدة إيجابية CD45.2 إيجابية من CD44، وخلايا T مساعدة إيجابية CD45.2 إيجابية CD4، وخلايا T إيجابية CD44 من خلايا T 17 إيجابية CD4، وخلايا T إيجابية CD44 غير متكاثرة بين خلايا CD45.2 الإيجابية من خلايا T الإيجابية. قم بجمع بيانات قياس التدفق الخلوي لجميع العينات.

أخيرا، حلل بيانات قياس التدفق الخلوي باستخدام برنامج FlowJo باستخدام نفس استراتيجية البوابة كما في جمع بيانات قياس التدفق الخلوي. زاد تكرار الخلايا التائية غير المتكاثرة بشكل ملحوظ تحت كل من التحفيز من T المساعد 1 وT 17 بعد الزراعة المشتركة مع الخلايا الغنية بالخلايا التائية المنظمة. تم تقليل تمايز خلايا الإنترفيرون غاما الإيجابية CD45.2 وخلايا الإنترفيرون جاما الإيجابية ومساعدة T 1 بشكل ملحوظ بعد الزراعة المشتركة مع خلايا T التنظيمية.

زاد تكرار خلايا المساعد الإيجابية للCD45.2 ونتيجة إيجابية للكلوديوم 44 و17A إيجابية لخلايا T المساعد 17 عندما تم زراعة خلايا T المستجيبة بخلايا غنية بالخلايا التائية التنظيمية. يتيح التحليل الوظيفي في المختبر لخلايا التريج دراسة التأثيرات البيولوجية الاتجاهية بين خلايا التريج والخلايا التائية المؤثرة على التكاثر والاستقطاب. أكبر تحدي أثناء تنفيذ هذا البروتوكول هو كيفية الحفاظ على بقاء الخلية مع ضمان نقاء خلايا التريج وخلايا التاي الساذجة.

بعد هذه العملية، يمكن لاختبارات ELISA وغيرها من الفحوصات الطبية الحيوية تقييم إنتاج السيتوكين والتأثيرات الأيضية، بينما تتيح الخلايا المصنفة في FACS تحليل تسلسل RNA وتحليل البروتينيات.