والفحص الكروماتين لأنسجة المخ الإنسان

مرحباً، أنا Amish Matan من مختبر الدكتورة Sha Mc Barian في قسم الطب النفسي بكلية الطب بجامعة ماساتشوستس (UMass Medical School). سأعرض لكم اليوم إجراءً لترسيب الكروماتين مناعياً في أنسجة الدماغ البشري بعد الوفاة. وبالرغم من أن الإجراء التالي ليس معقداً للغاية.

إن الأمر الأكثر إثارة هو أن دراسات التعبير في الدماغ البشري كانت تقتصر حتى وقت قريب على التكميم البسيط لـ mRNA والبروتين. وستمنحنا هذه التقنية تحديداً فهماً أفضل للأساس الميكانيكي للتعبير الجيني في الدماغ البشري السليم والمريض على حد سواء. لذا، فلنبدأ في إجراء الترسيب المناعي للكروماتين.

بدأنا باستخدام أنسجة دماغ بشرية تم تشريحها مسبقاً من عينات مجمدة بعد الوفاة. ومن المهم استخدام نظارات السلامة والعمل في منطقة مخصصة للتعامل مع الأنسجة البشرية. وعند معالجة هذه العينات، يتم غمر نسيج الدماغ بخمسة أضعاف حجم الدماغ من محلول التثبيت (down sink buffer).

بمجرد أن تبدو جميع الأنسجة متجانسة داخل المحلول، يمكننا نقلها إلى أنبوب سعة 2 مل. بعد تجنيس الأنسجة، أضف خمس وحدات لكل مل من micro cocal nuclease إلى العينة واخلط المحلول عن طريق السحب والطرد بالماصة. ثم ضعها على الثلج.

من المهم تنفيذ هذه الخطوة بسرعة، نظرًا لأن micro coccal nuclease لديه القدرة على العمل حتى في درجة حرارة 4 °C. وبمجرد معالجة جميع العينات باستخدام micro coccal nuclease، ننقلها سريعاً إلى حمام مائي بدرجة حرارة 37 °C ونحضن العينات لمدة سبع دقائق.

بعد فترة حضانة استمرت سبع دقائق، نضيف EDTA بتركيز 0.5 مولارية للوصول إلى تركيز 10 ملي مول لإيقاف نشاط إنزيم micrococcal nuclease. وبذلك نصبح مستعدين الآن للانتقال إلى خطوة الترسيب. وبعد أن قمنا بمعالجة عيناتنا، التي تحتوي على الحمض النووي النيوكليوزومي، بإنزيم micrococcal nuclease، سنبدأ عملية الترسيب.

ستأخذ نافا أنبوب Falcon سعة 15 ml، والذي سنضيف إليه 4.5 ml من EDTA بتركيز 0.2 millimolar، و2.5 µL من benadine بتركيز 0.2 molar، و4.5 µL من PMSF بتركيز 0.1 molar في هذا الأنبوب. بعد ذلك، سنقوم بنقل العينة. ثم نحضن العينة لمدة ساعة واحدة على الثلج مع رجها بواسطة جهاز vortex كل 10 دقائق.

في نهاية فترة الحضن التي تستمر لمدة ساعة، سنقوم بإضافة 2.5 µL من DTT بتركيز 3 M. يتم رج العينة باستخدام جهاز الـ vortex مرة أخرى، ثم تُفصل في جهاز طرد مركزي باستخدام دوّار ذي دلاء متأرجح (swing bucket rotor) عند 3,175 RCF لمدة 10 دقائق عند درجة حرارة 4 °C. بعد عملية الطرد المركزي، يتم توزيع السائل الطافي، بحيث تُستخدم 500 µL كعينة تحكم للمدخلات (input control)، والتي ستحتوي فقط على genomic DNA، ويُقسم المتبقي على أنبوبتين تحتوي كل منهما على 1,600 µL من العينة، والتي ستكون عينات الترسيب المناعي للكروماتين (chromatin immunoprecipitation).

يُحفظ ضابط الإدخال عند درجة حرارة 80- درجة مئوية طوال الليل حتى وقت الاستخدام. بعد ذلك، نضيف 160 µL من 10 XFSB، وهو ما يعادل عُشر حجم العينة. وبالتزامن مع ذلك، نضيف 4 µg من الجسم المضاد.

قم الآن برج العينات باستخدام جهاز الـ vortex، ثم قم بتدويرها عند درجة حرارة 4 °C طوال الليل. وبعد الحضانة الليلية، سنقوم بغسل حبيبات البروتين التي ستُستخدم لعزل الحمض النووي النيوكليوسومي. ونظرًا لأن هذه الحبيبات حساسة للغاية، فمن الضروري قطع رؤوس نصال الماصة عند التعامل معها.

يتم ذلك لضمان وجود مساحة أكبر للخرز أثناء عملية السحب بالماصة. الآن، أضف 1.6 mils من خرز XFS بتركيز one إلى 245 µL من بروتينات jaguars في أنبوب طرد مركزي دقيق سعة two mil. يجب أن تكون هذه الكمية كافية لأربعة أنابيب من العينات.

بعد ذلك، يتم تقسيم محلول الخرز إلى أنبوبين بحجم 2 مل، ثم يُملأ كل منهما حتى 1.6 مل باستخدام XFSB واحد. تُدوّر الأنابيب في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 ثانية على جهاز تدوير، ثم تُطرد مركزياً عند 0.1 RCF لمدة 30 ثانية. بعد الطرد المركزي، يتم إزالة ATE باستخدام المكنسة الكهربائية.

أضف 1.6 µL من محلول one XFSB. مرة أخرى، قم بتدوير العينات لمدة 30 ثانية باستخدام جهاز تدوير (rotator)، ثم قم بطردها مركزياً مرة أخرى عند 0.1 RCF FS لمدة 30 ثانية. بعد عملية الطرد المركزي، نقوم بإزالة السائل الطافي مرة أخرى ودمج كلا الأنبوبين مع 1.5 µL من محلول one XFSB.

أضف أيضاً 15 µL من الحمض النووي للحيوانات المنوية. الآن، قم بالتدوير في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة، ثم قم بالطرد المركزي عند 0.1 RCF لمدة 30 ثانية. تخلص من السائل الطافي وأضف 200 µL من محلول one XFSB.

أضف الآن 90 µL من agro speeds إلى كل عينة ترسيب كروماتين، ثم قم بتدويرها عند درجة حرارة 4 °C لمدة ساعة واحدة. ولضبط التحكم السلبي، أضف 1 mL من 1X FSB إلى ما تبقى من agro speeds وقم بتدويره مع عينة الترسيب المناعي للكروماتين عند درجة حرارة 4 °C لمدة ساعة واحدة. وخلال فترة الحضانة التي تستغرق ساعة واحدة، يمكننا استغلال الفرصة لتحضير كمية من محلول الرفع الطازج.

سيتم استخدام هذا لاحقاً في التجربة بعد فترة الحضانة التي تستغرق ساعة واحدة. قم بمركزة العينات والضابط السلبي عند 0.1 CFS لمدة 30 ثانية ثم تخلص من supernatant. بعد ذلك، سنقوم بغسل الحبيبات بأربعة أنواع مختلفة من محاليل الغسل: محلول غسيل منخفض الملوحة، ومحلول غسيل عالي الملوحة، ومحلول كلوريد الليثيوم، وأخيراً، محلول TE buffer عند pH 8.

بالنسبة لكل محلول منظم باستثناء محلول كلوريد الليثيوم، سنقوم بتدوير العينات لمدة ثلاث دقائق في درجة حرارة الغرفة، ثم سنقوم بطردها مركزياً عند 0.1 R Cs لمدة 30 ثانية. أما بالنسبة لغسيل كلوريد الليثيوم، فتدور العينات في درجة حرارة الغرفة لمدة دقيقة واحدة فقط. بعد كل عملية غسيل، يتم التخلص من الراشح باستخدام جهاز شفط.

نحن الآن مستعدون للمضي قدماً في شطف عيناتنا. لبدء خطوة الشطف، نضيف 250 µL من محلول الشطف (elu buffer) المُحضّر حديثاً إلى كل عينة. يتم تدوير العينات لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة، ثم يتم إجراء عملية الطرد المركزي عند 0.4 RCF لمدة دقيقة واحدة.

الآن، احفظ السائل الطافي في أنبوب برتقالي سعة 2 مل. ثم أضف 250 µL من محلول الاستخلاص (evolution buffer) إلى كل عينة. مرة أخرى، قم برجّ جميع الأنابيب يدوياً باستخدام جهاز الـ vortex لبضع ثوانٍ.

ثم قم برج العينات باستخدام جهاز الرج (vortex) لمدة 15 دقيقة، وبعد الرج لمدة 15 دقيقة، قم بتدوير الأنابيب في جهاز الطرد المركزي. اضبط الجهاز على 16 RCF لمدة أربع دقائق واحفظ الرواسب (pellet) في نفس الأنبوب سعة 2 mL. ولهضم البروتين في عيناتنا، أضف أولاً 10 µL من 0.5 M DTT و25 µL من 0.8 M Tris-HCl عند pH 6.5 و2.5 µL من 10 mg/mL proteinase K إلى كل عينة من عينات الترسيب المناعي للكروماتين (chromatin immunoprecipitation).

أضف إلى كل عينة تحكم (input control) مقدار 15 µL من محلول التحلل (lysis buffer) و 2.5 µL من Proteinase K بتركيز 10 mg/mL. قم بتحضين كل من عينات التحكم وعينات الترسيب المناعي للكروماتين (chromatin immunoprecipitation) في درجة حرارة 52 °C لمدة ثلاث ساعات على الأقل. وبعد انتهاء فترة التحضين التي استمرت ثلاث ساعات، يمكننا البدء في عملية استخلاص الفينيل كلورو فورم (phenol chloroform extraction).

بعد فترة تحضين مدتها ثلاث ساعات، نضيف 500 µL من phenyl chloroform إلى كل عينة. يتم تنفيذ هذه الخطوة داخل خزانة طرد الغازات (الشفاط) نظراً لأن phenyl chloroform مادة كيميائية عضوية ضارة سواء عند ملامسة الجلد أو عند استنشاقها. بعد ذلك، نقوم برج جميع العينات باستخدام جهاز الـ vortex لعدة ثوانٍ، ثم نضعها في جهاز الطرد المركزي عند 13 RCF لمدة خمس دقائق.

يجب أن تظهر طوران داخل الأنابيب. وبما أننا مهتمون بمحتويات الطور العلوي، فسنقوم بسحب الطور العلوي ووضعه في أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 2 ml. بعد ذلك، تُضاف إلى كل عينة خليط مكون من 2 µL من الجليكوجين و 50 µL من خلات الصوديوم بتركيز 3 M، بالإضافة إلى 1.375 ml من الإيثانول بتركيز 100%.

يتم رج جميع العينات بقوة باستخدام جهاز المرج (vortex) ثم تُحفظ في درجة حرارة 80- °C طوال الليل. وبعد الحضن ليلة كاملة، توضع العينات على الثلج لإذابتها، ثم تُفصل بواسطة الطرد المركزي عالي الكثافة عند 15 RCF لمدة 10 دقائق في درجة حرارة 4 °C.

بعد عملية الطرد المركزي، قم بإزالة السائل العلوي بعناية دون تعكير الراسب الموجود في قاع الأنبوب. بعد ذلك، أضف 1 mL من الإيثانول البارد بتركيز 75% إلى كل عينة، وقم بقلبها جميعاً من أربع إلى ست مرات. ثم تُطرد الأنابيب مركزياً مرة أخرى عند 18 RCF لمدة خمس دقائق عند درجة حرارة 4 °C.

تتم إزالة السائل الطافي مرة أخرى، وتُترك الرواسب لتجف في الهواء. وبمجرد جفاف الرواسب، يتم إذابتها في 50 µL من حمض HCL بتركيز 4 mM وبقيمة pH 8، وتُخزن عند -80 °C حتى حين استخدامها. حسنًا، لقد شرحت لكم للتو كيفية إجراء الترسيب المناعي للكروماتين على أنسجة الدماغ البشري المجمدة بعد الوفاة.

وتذكر أنه عند تنفيذ هذا الإجراء، من المهم اتخاذ كافة الاحتياطات اللازمة عند التعامل مع أنسجة الدماغ البشري والكروماتين؛ حيث يمكن استخدام مقاييس الترسيب المناعي لتعزيز فهم التعبير الجيني في الدماغ البشري السليم والمصاب على حد سواء. هذا كل شيء، شكراً للمشاهدة وبالتوفيق في تجاربكم.