التصوير T الذاكرة المستجيب الخلايا في الأذن بعد تحريض DTH بالتبني

مرحباً، أنا ميلاني ماثيو، طالبة دراسات عليا في مختبر ميكاه هولينز بجامعة كاليفورنيا إيرفين في قسم الفسيولوجيا والفيزياء الحيوية. وسنوضح لكم اليوم، بالتعاون مع الدكتورة كريستين بيتون، كيفية تصوير الخلايا التائية الذاكرة أو المستجيبة في أذن الجرذ.

ستقوم الدكتورة Christine Beaton أولاً بتحفيز فرط الحساسية المتأخر DTH في أذن الجرذ. ومن ثم سننتقل إلى التصوير الموضعي لأذن الجرذ باستخدام مجهر فوتوني. لقد قمت قبل يومين بحقن خلايا T نوعية للألبومين وموسومة بـ GFP في جرذ Lewis.

واليوم سأقوم بتحدي نفس الجرذ في الأذن؛ حيث سأقوم بحقن الألبومين في الأذن اليمنى، بينما سأحقن مادة PBS في الأذن اليسرى.

جرعة الألبومين التي سأقوم بحقنها هي 20 µg في 20 µL. والألبومين المستخدم هو خليط بنسبة واحد إلى واحد من ألبومين مُوصوم بـ Texas Red وألبومين غير مُوصوم. وهذا هو الجزء الأيمن الذي سأوضح لكم من خلاله كيفية عملية الحقن.

بما أنني أيمن، فقد نزعت القفاز عن يدي اليسرى لأتمكن من وضع إصبع تحت الأذن والإصبع الآخر فوقها لشد الجلد، بحيث أتمكن من رؤية موقع الإبرة بدقة والدخول بين طبقتي الجلد في المنطقة الهوائية، وهي طبقة رقيقة جداً. ولذلك، أستخدم إبراً بقياس 27 gauge للحصول على أداة رفيعة للغاية للدخول هناك.

لذا، إذا قمت بتدويره، ستلاحظ بوضوح أين ذهب صبغ Texas red وأين ذهب محلول PBS. لقد مر الآن 42 ساعة بعد عملية التحدي هنا، وسأستخدم ميكرومترًا نابضًا لقياس سمك الأذن. سأقوم بقياس كلتا الأذنين؛ الأذن اليمنى التي تعرضت للتحدي بالألبومين، والأذن اليسرى التي لم تتعرض للتحدي، وسيعطينا الفرق في سمك الأذنين فكرة عن شدة الالتهاب.

أوه، 62 0 60 0 61، 0 60 أو 58 أو 57 أو 57. والأذن الأخرى 4 49 4 55 4 48.4 47 4 46، 4 50. مرحباً. لقد أعطتنا كريستين بيتون للتو الجرذ الذي قامت بإزالته بعد قياس استجابة اختبار تفاعل الحساسية المتأخر (DTH).

لقد نقلناها إلى هنا على الثلج. هذه هي الأذن اليسرى للجرذ. ونحن الآن هنا في مختبر إيان باركر لإجراء المجهرية ثنائية الفوتون.

سأقوم الآن بتحضير هذه الآذان للتصوير ثنائي الفوتون في الموضع (in situ). لذا سأقوم بتحضير إحدى آذان الجرذ هنا عند قاعدة الأذن. فالنسيج أكثر سمكاً، وهناك بعض الشعر البارز الذي قد يسبب بعض الفوضى إذا بدأت في القطع مباشرة.

أول شيء سأقوم به هو قص بعض من هذا الشعر. أنا أمسك الأذن بلطف، حيث يسهل استخدام إصبعي التحكم في الأنسجة عند إمساكها بين الإبهام والسبابة.

أفضل هذه الطريقة على استخدام الملاقط، لأنني ببساطة لا أستطيع الشعور بما يحدث للأنسجة بسهولة عند استخدام الملاقط، ونحن نخشى دائمًا من إتلاف الأنسجة. لذا، نريد أن نكون قادرين على الشعور بما نفعله بها، ولهذا أفضل استخدام أصابعي.

هذه هي الطبقة الأدمية وهي تتقشر من هنا في أذن الجرذ. لذا، بينما كنت أقوم بتهذيب بعض الشعر، تمكنت من تقليم بعض تلك الأدمة برفق حيث تتقشر ببساطة. هناك مقصات تشريح صغيرة جداً للقيام بذلك، مجرد مقصات منحنية جيدة.

لا ينبغي وخز الأنسجة، ويمكنك العمل تدريجياً من قاعدة الأذن وصولاً إلى الأعلى، مع قطع جزء من الطبقة الجلدية برفق. لذا، لسنا بحاجة إلى نافذة كبيرة جداً للتصوير؛ فهذه المنطقة هنا ستكون كافية للحصول على صور جيدة للخلايا التي تتسلل إلى الأنسجة.

كما تلاحظون، لا تزال هناك بعض الأوعية الدموية السليمة هنا عند قاعدة الأذن وصولاً إلى طرفها تقريباً. ستكون هذه المنطقة بأكملها مناسبة جداً لتصوير استجابة فرط الحساسية المتأخر (DTH). لذا سأقوم الآن بقص قطعة النسيج التي كشفتها لإعداد قطعة صغيرة من النسيج يمكننا لصقها على منصة التصوير.

لذا، قم بإجراء قطع هنا، ثم أدرها. يمكنني القطع هنا. أصبح لدينا الآن قطعة صغيرة جيدة من النسيج يمكننا تحضيرها على مجهر الفوتونين للتصوير.

هذه أغطية شرائح بلاستيكية غير قابلة للكسر، قمنا بقصها لتناسب حجم النسيج. بعد ذلك، نقوم بتثبيت النسيج عليها باستخدام مادة bet bond. ومن ثم، نقوم بتثبيت هذه الأغطية البلاستيكية غير القابلة للكسر على منصة التصوير في الموضع (insitu imaging stage) باستخدام الشحم السيليكوني.

سآخذ هذه القطعة الصغيرة من نسيج الأذن، وهي تحتوي على انحناء بسيط، لذا سأضطر إلى تسويتها أثناء لصقها. هذا ليس الوضع المثالي، لكنه سيفي بالغرض. لذا، ما عليك سوى أخذ إحدى هذه الشرائح الغطائية وقصها، مع تقدير حجم أذنك وقص قطعة أكبر قليلاً مما تعتقد أنها ستكون عليه.

لتثبيت النسيج على شريحة الغطاء، نستخدم غراءً فائقاً آمناً للأنسجة يُسمى bet long. نحصل عليه من شركة 3M ونضع بضع قطرات منه على شريحة الغطاء.

لا أريد وضع كمية كبيرة. كما يجب التأكد من توزيعها بشكل متساوٍ. لذا، سآخذ قطعة صغيرة من ورق العدسات وأستخدم زاويتها لسحب الغراء وتوزيعه فوق غطاء الشريحة هنا.

سأضيف القليل من الصمغ الإضافي، وبمجرد أن يلامس هذا الصمغ الماء، سيتصلب. لذا، يجب توخي الحذر الشديد عند التعامل مع عينة النسيج. سأمسك بزاوية النسيج هنا، والتي من المرجح ألا نقوم بتصويرها لأنها تقع في الجزء المنحني.

سأقوم بتجفيفه قليلاً. الجزء السفلي منه، فقط باستخدام ورق العدسات لضمان تجفيفه تماماً. ثم سأقوم بملامسة زاوية نسيج أذن الجرذ هذا بغطاء الشريحة.

ويجب أن يتصلب فوراً في مكان لمسي له. أما بقية الأجزاء، فسأقوم بتسويتها قليلاً من خلال الضغط بلطف على الحواف، لنحصل على إطار تصوير جيد.

سأقوم الآن بمعالجة الغراء عن طريق غمسه في الوسط الغذائي. ومن أجل منع وصول الغراء إلى الجزء العلوي من النسيج، نقوم بقلبه رأساً على عقب، ثم نغمسه ببطء بحيث يلامس أحد الزوايا أولاً خزان الوسط الغذائي، وعندها من المفترض أن يلتصق بشكل جيد، وبذلك يمكننا تصويره في غرفة تصوير الأنسجة. والآن سنقوم بتثبيت قطعة النسيج التي جهزناها للتصوير الموقعي، وهي قطعة من نسيج الكبد، على المنصة.

إليك قطعة النسيج مع وجود الشحم السيليكوني في قاعدتها، وسنقوم ببساطة بوضعها برفق في تدفق الوسط الغذائي. الآن أصبحت قطعة النسيج مثبتة بأسفل المسرح بواسطة الشحم السيليكوني. نبدأ تدفق الوسط الغذائي مع وضع مسبار درجة الحرارة بجانبه مباشرة.

والآن سنقوم بالتركيز. لذا سأقوم بتشغيل وحدة التركيز، والضوء الجديد، والضوء الساطع. سأستخدم الآن الشيئية بقوة تكبير 20x وأقوم بخفضها داخل الحجرة.

تأكد من عدم ملامسته للأنسجة. انظر عبر العدسة العينية وقم بضبط التركيز على أنسجة الأذن. وها هي أمامنا.

تظهر هنا بصيلات شعر خضراء ذات فلورية ذاتية في الطبقة الأدمية لأذن الجرذ. وتحيط بهذه البصيلات طبقة كثيفة من الكولاجين. وهذه هي الطبقة التي نقوم بإزالتها من أجل تصوير الخلايا التائية الذاكرة (T fector memory cells) باستخدام فوتونات T.

ستؤدي بصيلات الشعر ذات الفلورية الذاتية إلى حجب الصورة، وكذلك الكولاجين الساطع في الطبقة الأدمية العليا. حسنًا، يمكنكم أن تروا هنا أن لدينا خلايا APCs قد امتصت volin المقترن بـ Texas red، وهي مستقرة على طول ألياف الكولاجين الزرقاء هذه. تظهر ألياف الكولاجين باللون الأزرق نتيجة لتوليد التوافقي الثاني الذي نحصل عليه في تصوير الفوتونات على طول ألياف الكولاجين.

لدينا خلايا t ذات حركية عالية. فهي تزحف صعوداً وهبوطاً على ألياف الكولاجين وتتفاعل مع الخلايا المقدمة للمستضد (APCs). لذا، رأيتم في هذا الفيديو الدكتورة Christine Beaton وهي تحفز استجابة فرط الحساسية المتأخر (DTH) التبني في جرذ Lewis.

وبعد ذلك، عرضنا لكم طريقة تحضير الأذن للتصوير، والخلايا التائية الذاكرة المستجيبة، وأذن الجرذ، وتقنيات الفوتونين التي استخدمناها لتحقيق ذلك.