عزل النواة من الخلايا العصبية البشرية تشريح أنسجة المخ

من أجل دراسة تفاعلات الحمض النووي للكروماتين التي تحكم التعبير الجيني المحدد للخلايا العصبية في الدماغ البشري ، يجب أولا الحصول على مجموعة نقية من النوى العصبية للقيام بذلك. يتم تجانس أنسجة المخ البشري بعد الوفاة ويتم عزل النوى الكلية باستخدام الطرد المركزي المتدرج الكثافة. ثم يتم تصنيف النوى بأجسام مضادة خاصة بالخلايا العصبية معزولة عن طريق الفرز المتري للتدفق ، وأخيرا تتركز باستخدام الطرد المركزي الفائق.

مرحبا ، أنا أنيش ماتان من مختبر الدكتور شارون ماك باريان هنا في قسم الطب النفسي بكلية الطب بجامعة ماساتشوستس. سأريكم اليوم إجراء لعزل النوى العصبية عن أنسجة المخ البشري بعد الوفاة. لذلك دعونا نبدأ.

لكل عينة نوى يتم فرزها ، ابدأ بألف ملليغرام من أنسجة المخ المجمدة بعد الوفاء. بهذه الكمية ، يمكنك الحصول على حوالي 5 ملايين نواة عصبية بعد الفرز المنشط بالفلورة. لبدء استخراج النوى ، ضع 250 ملليغرام من أنسجة المخ في أسفل يحتوي على خمسة مل من محلول التحلل ، وضعه على الجليد.

بمجرد أن يذوب النسيج لمدة دقيقة واحدة أثناء وجوده على الجليد. بعد الهبوط ، انقل الأنسجة المتجانسة إلى أنبوب طرد مركزي فائق الشفاف سعة 15 مل ثم ضع الأنبوب على الجليد. كرر هذا التجانس للأنسجة المتبقية.

بعد ذلك ، قم بعمل تسعة ميل من محلول السكروز بعناية في قاع أنابيب الطرد المركزي الفائق لإعداد تدرج تركيز بحيث يكون محلول الأنسجة المتجانسة أعلى محلول السكروز. الآن قم بوزن أنابيب الطرد المركزي الفائق للتأكد من أنها متوازنة أثناء الطرد المركزي الفائق. قم بإجراء أي تعديلات على الوزن عن طريق إضافة عازلة التحلل إلى الطبقة العليا بعد وزن الأنابيب ، ضعها في جهاز الطرد المركزي الفائق باستخدام عينات أجهزة الطرد المركزي الفائقة الدوار SW 28 عند 107163.6 RCF لمدة 2.5 ساعة عند أربع درجات.

بمجرد اكتمال الطرد المركزي ، قم بالشفط من snat وكذلك طبقة الحطام الموجودة عند تدرج التركيز. احرص على عدم إزعاج الحبيبات الموجودة في قاع الأنبوب الذي يحتوي على النوى. بعد ذلك ، أضف 500 ميكرولتر من XPBS واحد إلى كل حبة واتركها على الجليد لمدة 20 دقيقة.

بعد 20 دقيقة ، قم بتعليق الكريات عن طريق سحب الكريات لأعلى ولأسفل. تسمح الحضانة على الجليد للكريات بالذوبان قليلا من تلقاء نفسها ، مما يسهل إعادة تعليق النوى ، وبالتالي تقليل مقدار الضغط الذي تتعرض له النوى. ثم انقل تعليق القناة والنوى إلى أنبوبين من أجهزة الطرد المركزي.

اجمع المحلول النووي من اثنين من أنابيب المئوية الفائقة إلى كل أنبوب مركزي صغير ومرة أخرى ، ضع العينات على الجليد. الآن بعد أن اكتمل الاستخراج النووي ، سأنتقل إلى خطوة التلوين المناعي من أجل عزل النوى العصبية عن طريق الواقع ، وسيتم احتضان فرز العينة المحتوية على النوى بخليط تلطيخ مناعي يتكون من جسم مضاد أولي وثانوي ، بالإضافة إلى روابط الحجب لصنع خليط التلوين المناعي عند 1.2 ميكرولتر من الجسم المضاد النوعي للخلايا العصبية الجديدة N إلى 300 ميكرولتر من XPBS واحد. ثم أضف مائة ميكرولتر من مزيج الحجب ، والذي يحتوي على 0.5٪ BS و A و 10٪ مصل كود عادي في XPBS واحد.

أخيرا ، أضف ميكرولتر واحدا من الجسم المضاد الثانوي المسمى LOR 4 88. قم أيضا بإعداد صبغة مناعية لعينة تحكم سلبية لخليط البقع المناعية هذا. استبعد الطرف الجديد للجسم المضاد الأساسي واستبدله ب 1.2 ميكرولتر من XPBS واحد.

مخاليط تلطيخ مناعية دوامة واحتضانها لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة في الظلام أثناء احتضان مخاليط التلوين. قم بإعداد عينات نوى التحكم لعينة التحكم السلبية Eloqua 20 ميكرولتر من نوى امتداد القناة في أنبوب بحجم ملتين يحتوي على 980 ميكرولتر من XPBS واحد. قم أيضا بإعداد عنصر تحكم غير ملطخ يحتوي على محلول النوى و PBS فقط.

الآن Eloqua 20 ميكرولترا من النوى في أنبوب آخر وارفع الحجم مرة أخرى إلى مل واحد باستخدام XPBS واحد. ثم ضع جميع العينات مرة أخرى على الجليد. الآن تم الانتهاء من مخاليط التلوين المناعي.

الحضانة إضافة 401 ميكرولتر من الخليط إلى العينة المناسبة. تلقت عينة النوى الخليط الذي يحتوي على كل من الجديد و LOR 4 88. تلقت عينة التحكم السلبية خليطا يحتوي فقط على الجسم المضاد الثانوي LOR 4 88 بينما لم تتم إضافة أي صبغة مناعية إلى عينة التحكم غير الملطخة.

بعد ذلك ، انقل العينات إلى الكولدرون وقم بتدويرها في الظلام لمدة 45 دقيقة. الآن بعد أن اكتملت الحضانة التي تبلغ مدتها 45 دقيقة ، سأقوم بنقل العينات إلى المنشأة الأساسية لقياس التدفق الخلوي بكلية الطب بجامعة ماساتشوستس للقيام ببعض الفرز المنشط بالفلورة أثناء النقل إلى المنشأة الأساسية ، يجب حفظ العينات على الجليد وفي الظلام. في المنشأة الأساسية لقياس التدفق الخلوي ، يتم ترشيح العينات أولا من خلال مرشح 40 ميكرون ثم يتم تشغيلها عبر الجهاز لبضع دقائق مع الحفاظ على البرودة.

يتم ذلك من أجل الحصول على بعض البيانات الأولية قبل الفرز. يحدد التحكم غير الملوثة درجة التألق السلبي. بناء على هذه المعلومات ، اضبط حساسية الماكينة للتألق.

يستخدم التحكم الملطخ للسيطرة على الأنفلونزا. أي ضوضاء خلفية ناتجة عن التألق في هذه المرحلة تحدد البوابات المناسبة المطلوبة للفرز. يتم استخدام عدة بوابات مختلفة لفرز العينات.

فيما يلي بعض البيانات النموذجية للبوابة الأولى. يعرض مخطط تحليل الفاكس هذا عينة تمثيلية بعد ضبط البوابة. تتعرف البوابة الأولى على أنماط الحطام والنوى القابلة للحياة بناء على مجموعة من الإعدادات مثل التألق والخبرة البصرية العامة.

يمثل المحور x مبعثرا أماميا ، والذي يتوافق مع الحجم النسبي بينما يمثل المحور Y تشتت الموقع ، والذي يفسر التعقيد الداخلي مثل التفاصيل. يمكن أن تعطي البوابة الأولى أيضا فكرة عن حجم النوى المختلفة الموجودة في العينة. يسمح هذا بفصل الحطام عن النوى الفعلية ، وإليك بعض البيانات النموذجية من البوابة الثانية.

يعرض مخطط الفاكس هذا مثالا على بوابة ثانية ، والتي تسمح بفرز النوى بشكل فردي مع التخلص من أي مجاميع. تبحث هذه البوابة في الاختلافات في أطوال الوقت التي تستغرقها النوى للمرور عبر الليزر. عادة ما تستغرق تلك التي هي مجاميع وقتا أطول للمرور.

هذه المعلمة الخاصة مهمة جدا لأن إدراج الركام يمكن أن يتداخل مع النقاء لأن بعض نواة الفلورسنت قد تكون مرتبطة بنواة غير فلورية. أخيرا ، إليك بيانات نموذجية من البوابة الثالثة. يتم ضبط هذه البوابة على طول موجي مضان محدد يطابق طول موجة الفلورون الموجود في الجسم المضاد الثانوي لدينا.

في مخطط الفاكس هذا، ترى مستوى التألق على طول المحور x وكاشف قناة حمراء عميقة، PECY سبعة على طول المحور Y. تعطي هذه البقع النقطية صورة أفضل عند مقارنتها ببساطة بالرسم البياني أحادي اللون. يسمح وضع SCADA بفرز وفصل النوى العصبية الجديدة والإيجابية عن النوى غير العصبية الجديدة والسلبية.

بعد اختيار جميع البوابات ، يتم فرز النوى إلى XPBS واحد. بمجرد مرور العينة بأكملها من خلال فرز الحقائق ، تحقق من نقاء الفرز عن طريق تشغيل Eloqua للعينة التي تم فرزها من خلال الأداة. فيما يلي مثال على النتيجة المثلى.

هنا قارن عينة presort ، التي تحتوي على مجموعة مختلطة من النوى ب Eloqua التي تم فرزها والتي قضت على معظم النوى السالبة. لاحظ أن نسب النقاء تستند إلى عدد الأحداث التي تلوث العينة بناء على البوابات التي تم تعيينها. ضع في اعتبارك أنه في المرة الأولى التي يتم فيها تشغيل العينة عبر الجهاز ، قد يحدث بعض التبييض ، مما يتسبب في بعض التعتيم في حساب ذلك ، وقد يلزم إجراء بعض التعديلات.

بمجرد فرز العينة ، ابدأ في معالجة النوى. للقيام بذلك ، خذ 10 مل من العينة المصنفة وأضف ملين من محلول السكروز ، و 50 ميكرولترا من كلوريد الكالسيوم المولي ، و 30 ميكرولترا من أسيتات المغنيسيوم المولارية. إذا كان هناك أقل من 10 مل من العينة التي تم فرزها ، فقم برفع مستوى الصوت حتى 10 مل عن طريق إضافة XPBS واحد أو ضبط المواد الإضافية وفقا لذلك.

بعد ذلك ، اقلب العينة عدة مرات وضعها على الجليد لمدة 15 دقيقة. بعد 15 دقيقة ، عينة ميزة centrif في دوار دلو متأرجح 1 ، 786 RCF لمدة 15 دقيقة عند أربع درجات. بعد الطرد المركزي ، قم بشفط المادة الطافية بعناية دون إزعاج الحبيبات البيضاء الموجودة في الجزء السفلي من الأنبوب.

ثم قم بإذابة الحبيبات في 200 ميكرولتر من المحلول المناسب اللازم للتجارب السابقة. في هذه الحالة، نقوم بإذابة المخزن المؤقت للحبيبات والهبوط لتجربة الشريحة اللاحقة. ثم أعد تعليق الحبيبات عن طريق الأنبوب لأعلى ولأسفل.

في هذه المرحلة ، يمكنك نقل النوى إلى أنبوب أصغر ووضعها في ثلاجة 80 درجة مئوية تحت الصفر. حتى الاستخدام الإضافي ، حسنا ، لقد أوضحت لكم للتو كيفية عزل النوى العصبية عن أنسجة المخ البشرية بعد الوفاة. باستخدام هذه النوى ، يمكنك إجراء عدد من التحليلات المختلفة مثل الترسيب المناعي للكروماتين.

عند القيام بهذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر دائما الاحتفاظ بعيناتك على الجليد لأن النواة غير ثابتة ويمكن أن تتحلل عند درجة حرارة طويلة. أيضا ، من المهم التعامل مع الأنسجة البشرية على مستوى السلامة البيولوجية اثنين أو معايير أمان أعلى. هذا كل شيء.

شكرا على المشاهدة ونتمنى لك السعادة في تجاربك.