عزل النواة من الخلايا العصبية البشرية تشريح أنسجة المخ

من أجل دراسة تفاعلات الحمض النووي للكروماتين التي تتحكم في التعبير الجيني الخاص بالعصبونات في الدماغ البشري، يجب أولاً الحصول على مجموعة نقية من النوى العصبونية للقيام بذلك. يتم تجنيس أنسجة الدماغ البشري بعد الوفاة وعزل إجمالي النوى باستخدام طرد مركزي بتدرج الكثافة. بعد ذلك، يتم وسم النوى بأجسام مضادة خاصة بالعصبونات ومعزولة عبر الفرز القياسي للتدفق، وأخيراً يتم تركيزها باستخدام الطرد المركزي الفائق.

مرحباً، أنا أنيش ماتان من مختبر الدكتورة شارون ماك باريان هنا في قسم الطب النفسي بكلية الطب في جامعة ماساتشوستس. سأعرض لكم اليوم إجراءً لعزل النوى العصبونية من أنسجة الدماغ البشري بعد الوفاة. فلنبدأ.

لكل عينة نوى سيتم فرزها، ابدأ بألف ملليغرام من أنسجة الدماغ المجمدة بعد الوفاة. وبهذه الكمية، يمكنك الحصول على حوالي 5 مليون نواة عصبية بعد الفرز المنشط بالفلورة. لبدء استخلاص النوى، ضع 250 ملليغرام من أنسجة الدماغ في أنبوب طرد مركزي يحتوي على 5 mils من محلول التحلل، وضعه على الثلج.

بمجرد ذوبان النسيج، قم بطحنه لمدة دقيقة واحدة أثناء وضعه على الثلج. بعد عملية الطحن، انقل النسيج المتجانس إلى أنبوب جهاز طرد مركزي فائق شفاف سعة 15 مل، ثم ضع الأنبوب على الثلج. كرر عملية التجانس هذه لبقية النسيج.

بعد ذلك، قم بسحب 9 ml من محلول السكروز بعناية باستخدام الماصة إلى قاع أنابيب جهاز الطرد المركزي الفائق لإنشاء تدرج في التركيز بحيث يكون محلول النسيج المتجانس فوق محلول السكروز. الآن، قم بوزن أنابيب جهاز الطرد المركزي الفائق للتأكد من توازنها أثناء عملية الطرد المركزي الفائق. قم بإجراء أي تعديلات على الوزن عن طريق إضافة محلول التحلل (lysis buffer) إلى الطبقة العليا. بعد وزن الأنابيب، ضعها في جهاز الطرد المركزي الفائق باستخدام دوّار SW 28، مع تدوير العينات عند 107163.6 RCF لمدة 2.5 ساعة عند درجة حرارة 4 °C.

بمجرد اكتمال عملية الطرد المركزي، اسحب السائل الطافي بالإضافة إلى طبقة الحطام الموجودة عند تدرج التركيز. احذر من تحريك الراسب الموجود في قاع الأنبوب، والذي يحتوي على النوى. بعد ذلك، أضف 500 µL من 1x PBS إلى كل راسب واتركه في الثلج لمدة 20 دقيقة.

بعد مرور 20 دقيقة، أعد تعليق الراسب عن طريق السحب والدفع باستخدام الماصة. تسمح عملية التحضين على الثلج للرواسب بالتحلل قليلاً من تلقاء نفسها، مما يسهل عملية إعادة تعليق النوى، وبالتالي يقلل من مقدار الإجهاد الذي تتعرض له النوى. بعد ذلك، انقل المعلق والنوى إلى أنابيب طرد مركزي سعة 2 مل.

اجمع المحلول النووي من اثنين من أنابيب الطرد المركزي الفائق في كل أنبوب طرد مركزي صغير، وضع العينات على الثلج مرة أخرى. الآن وبعد اكتمال استخلاص الأحماض النووية، سأنتقل إلى خطوة الصبغ المناعي لعزل النوى العصبية؛ حيث سيتم تحضين العينة التي تحتوي على النوى مع مزيج صبغ مناعي يتكون من أجسام مضادة أولية وثانوية، بالإضافة إلى روابط حجب. لتحضير مزيج الصبغ المناعي، أضف 1.2 µL من الجسم المضاد النوعي للعصبونات NeuN إلى 300 µL من 1x PBS. ثم أضف 100 µL من مزيج الحجب، الذي يحتوي على 0.5% BSA و10% مصل أرنب طبيعي في 1x PBS.

أخيرًا، أضف واحد ميكروليتر من الجسم المضاد الثانوي المسمى LOR 4 88. قم أيضًا بتحضير صبغة مناعية لعينة ضابطة سالبة لهذا الخليط من الصبغة المناعية. استبعد الجسم المضاد الأولي واستبدله بـ 1.2 ميكرولتر من 1x PBS.

الآن، قم برجّ خلائط الصبغ المناعي باستخدام جهاز المرج (vortex) واحضنها لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة في الظلام أثناء فترة حضانة خلائط الصبغ. قم بتحضير عينات النوى الضابطة لعينة الضابط السلبي عن طريق إضافة 20 µL من النوى المعلقة إلى أنبوب سعة 2 مل يحتوي على 980 µL من 1X PBS. كما قم بتحضير ضابط غير مصبوغ، والذي يحتوي على محلول النوى و PBS فقط.

الآن، انقل 20 µL من النوى إلى أنبوب آخر وارفع الحجم مرة أخرى إلى 1 mL باستخدام 1X PBS. ثم ضع جميع العينات مرة أخرى على الثلج. وبذلك تكون خلائط الصبغ المناعي قد اكتملت.

أثناء التحضين، أضف 401 µL من المزيج إلى العينة المناسبة. تلقت عينة النواة المزيج الذي يحتوي على كل من الجديد و LOR 4 88. وتلقت عينة الضابط السلبي مزيجاً يحتوي فقط على الجسم المضاد الثانوي LOR 4 88، بينما لم يتم إضافة أي صبغة مناعية إلى عينة الضابط غير المصبوغة.

بعد ذلك، انقل العينات إلى جهاز التدوير المبرد وقم بتدويرها في الظلام لمدة 45 دقيقة. الآن وبعد اكتمال فترة الحضن التي استغرقت 45 دقيقة، سأقوم بنقل العينات إلى مرفق التدفق الخلوي المركزي في كلية الطب بجامعة ماساتشوستس لإجراء فرز منشط بالفلورة. أثناء النقل إلى المرفق المركزي، يجب حفظ العينات على الثلج وفي الظلام. في مرفق التدفق الخلوي المركزي، يتم أولاً ترشيح العينات عبر مرشح بقطر 40 micron، ثم تُمرر عبر الجهاز لبضع دقائق مع الحفاظ عليها باردة.

يتم القيام بذلك من أجل الحصول على بعض البيانات الأولية قبل عملية الفرز. حيث تحدد عينة الضابط غير المصبوغة درجة الفلورة السلبية. وبناءً على هذه المعلومات، يتم ضبط حساسية الجهاز للفلورة.

تُستخدم العينة الضابطة المصبوغة للتحكم في الفلورية. وأي ضجيج في الخلفية ناتج عن الفلورية في هذه المرحلة يُستخدم لتعيين البوابات المناسبة المطلوبة لعملية الفرز. تُستخدم عدة بوابات مختلفة لفرز العينات.

إليك بعض البيانات النموذجية للبوابة الأولى. يظهر مخطط تحليل هذا الـ fax عينة ممثلة بعد ضبط البوابة. تتعرف البوابة الأولى على أنماط الحطام والنوى الحيوية استناداً إلى مجموعة من الإعدادات مثل الفلورة والخبرة البصرية العامة.

يمثل المحور x التشتت الأمامي، والذي يتناسب مع الحجم النسبي، بينما يمثل المحور Y التشتت الجانبي، والذي يعبر عن التعقيد الداخلي مثل الحبيبات. كما يمكن للبوابة الأولى أن تعطي فكرة عن حجم النوى المختلفة الموجودة في عينتنا. وهذا يتيح فصل الحطام عن النوى الفعلية، وإليك بعض البيانات النموذجية من البوابة الثانية.

يوضح مخطط الفاكس هذا مثالاً للبوابة الثانية، والتي تسمح بفرز النوى بشكل فردي مع التخلص من أي تجمعات. تعتمد هذه البوابة على الاختلافات في الفترات الزمنية التي تستغرقها النوى للمرور عبر الليزر، حيث تستغرق التجمعات عادةً وقتاً أطول للمرور.

تعد هذه المعلمة تحديداً مهمة للغاية، حيث أن تضمين التجمعات قد يؤثر على النقاء نظراً لأن بعض النوى الفلورية قد تكون مرتبطة بنوى غير فلورية. وأخيراً، إليكم البيانات النموذجية من البوابة الثالثة؛ حيث تم ضبط هذه البوابة على طول موجي فلوري محدد يتطابق مع الفلوروفور الموجود في الأجسام المضادة الثانوية لدينا.

في هذا المخطط البياني، يظهر مستوى الفلورة على طول المحور x، وكاشف القناة الحمراء العميقة، PECY 7، على طول المحور Y. وتوفر هذه البقع النقطية رؤية بصرية أفضل عند مقارنتها بمخطط تكراري أحادي اللون. ويسمح وضع SCADA بفرز وفصل النوى العصبونية الإيجابية عن النوى غير العصبونية السلبية.

بعد اختيار جميع البوابات، يتم فرز النوى في أنبوب XPBS واحد. وبمجرد مرور العينة بأكملها عبر عملية الفرز الفعلي، يتم التحقق من نقاء الفرز عن طريق تمرير Eloqua من العينة المفروزة عبر الجهاز. إليك مثال على نتيجة مثالية.

قارن هنا بين عينة ما قبل الفرز، والتي تحتوي على مجموعة مختلطة من النوى، وبين عينة Eloqua المفرزة التي تم فيها استبعاد معظم النوى السلبية. لاحظ أن نسب النقاء تعتمد على عدد الأحداث التي تلوث العينة بناءً على البوابات التي تم ضبطها. ضع في اعتبارك أنه عند تمرير العينة عبر الجهاز للمرة الأولى، قد يحدث بعض البهتان، مما يؤدي إلى خفوت بعض الإشارات؛ ولتعويض ذلك، قد يلزم إجراء بعض التعديلات.

بمجرد فرز العينة، ابدأ في معالجة النوى. وللقيام بذلك، خذ 10 mils من العينة المفرزة وأضف إليها 2 mils من محلول السكروز، و50 µL من كلوريد الكالسيوم بتركيز 1 M، و30 µL من خلات المغنيسيوم بتركيز 1 M. إذا كانت كمية العينة المفرزة أقل من 10 mils، ارفع الحجم إلى 10 mils بإضافة 1 XPBS أو قم بتعديل المواد المضافة وفقاً لذلك.

بعد ذلك، اقلب العينة عدة مرات وضعها على الثلج لمدة 15 دقيقة. وبعد مرور 15 دقيقة، قم بإجراء عملية طرد مركزي للعينة باستخدام دوّار ذي دلاء متأرجحة بسرعة 1,786 RCF لمدة 15 دقيقة عند درجة حرارة أربع درجات مئوية. وبعد الطرد المركزي، اسحب السائل الطافي بعناية دون المساس بالراسب الأبيض الموجود في قاع الأنبوب.

ثم قم بإذابة الراسب في 200 µL من المحلول المناسب اللازم للتجارب السابقة. في هذه الحالة، نقوم بإذابة الراسب في محلول التخفيف (downing buffer) من أجل تجربة الشريحة اللاحقة. بعد ذلك، أعد تعليق الراسب عن طريق السحب والضخ باستخدام الماصة.

في هذه المرحلة، يمكنك نقل النوى إلى أنبوب أصغر ووضعه في مجمد عند درجة حرارة -80 درجة Celsius. وحتى حين استخدامها لاحقاً، حسناً، لقد أظهرت لك للتو كيفية عزل النوى العصبونية من أنسجة الدماغ البشري بعد الوفاة. وباستخدام هذه النوى، يمكنك إجراء عدد من التحاليل المختلفة مثل الترسيب المناعي للكروماتين.

عند إجراء هذا الإجراء، من المهم تذكر الاحتفاظ بالعينات دائماً على الثلج، حيث أن النوى غير مثبتة ويمكن أن تتحلل عند درجات الحرارة المرتفعة. كما أنه من الضروري التعامل مع الأنسجة البشرية وفقاً لمعايير السلامة في المستوى الثاني من السلامة البيولوجية أو أعلى. هذا كل شيء.

شكرًا للمشاهدة، وبالتوفيق في تجاربكم.