والفحص السلوكية لقياس الاستجابة للاسماك الزرد إلى التغيرات في شدة الضوء

في مختبر داولينج ، ندرس فسيولوجيا وتطور شبكية العين في أسماك الحمار الوحشي من أجل تحديد ما إذا كانت طفرات أسماك الحمار الوحشي غير القادرة على اكتشاف الحركة يمكنها اكتشاف الضوء وليست عمياء أم لا. نقوم باختبار استجابتهم الحركية البصرية أو VMR للقيام بذلك. نجمع أسماك الحمار الوحشي بعد حوالي أربعة أيام من الإخصاب.

ضعهم في 96. تقوم ألواح الآبار بإعداد جهاز تصوير مناسب ، ومحاذاة برنامج تتبع الفيديو مع اللوحة ، ثم تتبع الاستجابة الحركية للأسماك بعد الانتقال من الضوء إلى الظلام أو الظلام إلى الضوء ، وهو ما نسميه VMR. مرحبا ، أنا فريدة عمران من مختبر جون داولينج وقسم البيولوجيا الجزيئية والخلوية في جامعة هارفارد.

وأنا جيسون ريو. أنا من مختبر ألكسندر شير ، أيضا في قسم البيولوجيا الجزيئية والخلوية في جامعة هارفارد. سنعرض لك اليوم الاستجابة الحركية البصرية في الزرد للزيادات والتخفيضات الخفيفة.

لذلك دعونا نبدأ. لبدء فحص الاستجابة الحركية البصرية ، قم أولا بزراعة يرقات سمك الزرد من النوع البري تحت دورة ضوء داكنة عند 28 درجة مئوية حتى أربعة أيام على الأقل بعد الإخصاب. دورة الظلام الفاتح النموذجية لدينا هي 14 ساعة من الأضواء التي تبدأ في الساعة 9:00 صباحا و 10 ساعات من إطفاء الأضواء بدءا من الساعة 11:00 مساء للحصول على أفضل النتائج السلوكية.

تجنب اكتظاظ اليرقات. عادة لا نحتفظ بأكثر من 50 يرقة في طبق بتري واحد. بعد خمسة أيام من الإخصاب ، نقوم بنقل أسماك الحمار الوحشي إلى صفيحة بئر 96 بحجم بئر 650 ميكرولتر من أجل منح اليرقات غرفة سباحة كبيرة.

باستخدام ماصة نقل البلاستيك ، انقل يرقات واحدة برفق لكل بئر. بعد نقل الأسماك إلى الآبار ، املأ كل بئر بما يكفي من مياه الأسماك بحيث يتدفق سطح الماء تقريبا إلى أعلى الآبار. احرص على عدم الإفراط في ملء الآبار أو عدم ملئها لتجنب المشاكل البصرية لكاميرا التسجيل.

احرص أيضا على عدم إدخال الفقاعات في الآبار. الأسماك جاهزة الآن للمراقبة بحثا عن استجاباتها للضوء والظلام. دعنا نأخذ سمكة الزرد المطلية إلى جهاز التسجيل.

لذلك دعونا ننتقل من خلال مسح جهاز التسجيل. سيتم وضع صفيحة البئر 96 التي تحتوي على الأسماك داخل غرفة التسجيل هنا في هذه الصينية البيضاء وتثبيتها في مكانها باستخدام زنبرك أو شريط مطاطي. يتم وضع الكاميرا في الجزء الخلفي من الصندوق هنا وتركز على اللوحة باستخدام المرايا الموجودة أعلى الصندوق الموجود هنا.

يمكن ضبط زاوية هذه المرايا عن طريق تدوير البراغي التي تثبت المرايا في مكانها. تضيء غرفة التسجيل من الأسفل بواسطة مصابيح LED بالأشعة تحت الحمراء. هذا يسمح للكاميرا بتسجيل الأسماك حتى في الظلام.

لا تستطيع اليرقات اكتشاف ضوء الأشعة تحت الحمراء ، لذا فإن إضاءة الأشعة تحت الحمراء المستمرة هذه لا تؤثر على التجربة. تضيء مصابيح LED البيضاء أيضا غرفة التسجيل من الأسفل. يتم التحكم فيها بشكل منفصل عن مصابيح الأشعة تحت الحمراء للتجارب التي تستمر لأكثر من بضع ساعات.

يمكن ملء الغرفة بالماء الجاري بلطف للمساعدة في الحفاظ على درجة حرارة ثابتة طوال المدة التجريبية. يتم ضخ المياه من خزان بواسطة مضخة حوض مائية صغيرة ويتم تسخينها إلى 28 درجة باستخدام سخان حوض السمك النموذجي تحت الماء. يتم تصريف المياه من خلال فتحة تصريف كبيرة ويتم إعادة تدويرها في الخزان لتقليل الاهتزاز الشارد من الغرفة.

تقع وحدة التسجيل بأكملها فوق طاولة توازن ثقيلة. عندما يكون جهاز التسجيل جاهزا ، يتم استخدام غطاء صندوق لتغطية وعزلها عن الضوء. الآن دعنا ننتقل إلى محاذاة 96.

لوحة جيدة مع شبكة الكمبيوتر الخاصة ببرنامج تتبع الفيديو للقيام بذلك في المقام الأول ، لوحة البئر 96 التي تحتوي على الأسماك في غرفة التسجيل. عند استخدام حمام مائي لإجراء تجارب طويلة الأمد ، ضع اللوحة ببطء في الماء ، مما يمنح مستوى الماء فرصة للتعديل دون الانسكاب على اللوحة. في برنامج مسار الفيديو وجهة النظر تحقق للتأكد من أن جميع اليرقات والتجربة مرئية على شاشة الكمبيوتر.

باستخدام عناصر التحكم في البرنامج ، قم بمحاذاة شبكة برنامج تتبع الفيديو مع آبار لوحة البئر 96 بحيث تكون كل سمكة داخل مربع من الشبكة. هذه الخطوة مهمة جدا لجميع تسجيلاتك. سيقوم كمبيوتر التتبع بحساب الحركة بشكل منفصل لكل مربع من هذه الصناديق.

لذلك إذا قمت بعدم محاذاة شبكة الكمبيوتر ، فقد تضيع بعض حركات الأسماك أو حتى أسوأ. ستشغل سمكتان متجاورتان نفس المنطقة ويتم احتسابها كسمكة واحدة بعد المحاذاة. تتم برمجة توقيت تشغيل وإطفاء الأضواء في الكمبيوتر.

نسمح عادة بثلاث ساعات من التكيف المظلم الفاتح في الصندوق. لا يحصل هذا على مستوى نشاط أساسي فحسب ، بل يمنح اليرقات أيضا فرصة للتهدئة بعد سحب العينات والمناولة. بعد ذلك ، نغلق باب غرفة التسجيل الخاصة بنا ونبدأ في التسجيل.

من الناحية العملية ، نسجل نشاط كل سمكة في الثانية ، لكن برنامج وجهة النظر في الواقع يسجل بيانات الإطار بالإطار. هنا أسفل الشاشة يمكنك رؤية أثر في الوقت الفعلي لسمكة واحدة. من حيث حركة البكسل ، يشير الخط الأبيض إلى أن عدد تغييرات البكسل أقل من عتبة محددة ويشير اللون الأخضر إلى أن تغيير البكسل أعلى من إعداد العتبة.

ستعتمد قيمة العتبة إلى حد ما على الكاميرا الخاصة بك وإعداد الضوء. بالنسبة لإعدادنا ، نستخدم عادة حدا من أربعة بكسل. أي إذا كان هناك أقل من أربعة بكسل يتغير ، فإنه يعتبر خلفية.

إذا كان هناك أكثر من أربعة وحدات بكسل تتحرك ، فهذا يشير إلى أن السمكة تتحرك. لقد قررنا تجريبيا أن هذا القطع يكتشف تقريبا جميع حركات السباحة والدوران لليرقات. على الرغم من أن صناديق التسجيل تعزل اليرقات جيدا إلى حد ما ، إلا أننا ما زلنا نطفئ الضوء في الغرفة ونحرص على تقليل الانقطاعات مع الضوضاء الميكانيكية ، مثل إغلاق وفتح الأبواب في الغرفة ، أو إقامة حفلة رقص أو القيام بإجراءات التمرين.

بعد اكتمال التجربة ، انقل البيانات التي تم جمعها إلى ورقة Excel أو إلى مجموعة التحليل المفضلة لديك. هذا ما تبدو عليه البيانات. يحتوي على الوقت والثواني من بداية التجربة ونشاط كل يرقات في الثانية.

فيما يلي رسم بياني يوضح نشاط يرقات واحدة طوال مدة التجربة مع العديد من استجابات التشغيل والإيقاف المشار إليها بواسطة الأسهم الموجودة على الرسم البياني. يوضح هذا الرسم البياني متوسط نشاط 40 سمكة طوال مدة التجربة مع العديد من الاستجابات المتقطعة والمغلقة كما هو موضح في الأسهم. كما ترى ، فإن الردود على التشغيل والإيقاف بارزة ومتسقة.

يمكن أيضا إجراء تجربة الاستجابة الحركية البصرية هذه على الأسماك الطافرة. في هذه الدراسات ، نقوم عادة بوضع الأسماك البرية والأسماك الطافرة على نفس اللوحة في مخطط لوح الشطرنج لأغراض التحكم المثلى. عند استخدام الأسماك الطافرة على نفس الطبق مثل الأسماك البرية ، تأكد من تدوين نوع الأسماك المطلية في كل منها. حسنا.

فيما يلي اقتراح حول كيفية تتبع الأسماك المطلية في كل منها. حسنا. فيما يلي نتائج الاستجابة الحركية البصرية ، والتي تقارن النوع البري واليرقات الطافرة. مرة أخرى ، نرى الاستجابات البارزة والمتسقة من يرقات النوع البري.

ومع ذلك ، فإن يرقات الطباشير المتحولة ، التي تفتقر إلى نمو العين ، لا تزيد بشكل كبير من نشاطها إما إلى زيادات خفيفة أو انخفاضات ولها مستوى أساسي منخفض من النشاط. تقارن هذه النتائج استجابات النوع البري مع طفرات NO OKR ، والتي تسمى أيضا طفرات NRC. كان يعتقد أن متحولة المجلس النرويجي للاجئين أعمى تماما بناء على اختبار OKR.

باستخدام اختبار VMR ، نوضح أن طفرة NRC لديها استجابة طبيعية وتأخر وبطيء في الاستجابة. وبالتالي ، فإن متحولة المجلس النرويجي للاجئين ليست أعمى تماما كما كان يعتقد سابقا. لقد أظهرنا لك للتو الاستجابة الحركية البصرية لمخبرة سمك الزرد للزيادات والتناقص الخفيف.

عند القيام بهذا الإجراء. من المهم أن تتذكر إجراء التجربة أثناء النهار لأن الأسماك تكون أكثر نشاطا واستجابة لتغيرات شدة الضوء أثناء النهار مقارنة بالليل. هذا كل شيء.

شكرا لك على المشاهدة ونتمنى لك التوفيق في تجاربك.