والفحص السلوكية لقياس الاستجابة للاسماك الزرد إلى التغيرات في شدة الضوء

نحن ندرس في مختبر داولينج فسيولوجيا وتطور الشبكية في أسماك الزيبرا لتحديد ما إذا كانت طفرات أسماك الزيبرا غير القادرة على اكتشاف الحركة يمكنها اكتشاف الضوء وأنها ليست عمياء. ونقوم باختبار استجابتها الحركية البصرية (VMR) لتحقيق ذلك. كما نقوم بجمع أسماك الزيبرا بعد حوالي أربعة أيام من الإخصاب.

ضعها في أطباق ذات 96 بئراً، وجهّز منصة تصوير مناسبة، ثم قم بمحاذاة برنامج تتبع الفيديو مع الطبق، وبعد ذلك تتبع الاستجابة الحركية للأسماك عقب الانتقالات من الضوء إلى الظلام أو من الظلام إلى الضوء، وهو ما نسميه VMR. مرحباً، أنا فريدة عمران من مختبر جون دولينج وقسم البيولوجيا الجزيئية والخلوية في جامعة هارفارد.

وأنا جيسون ريو، من مختبر ألكسندر شير، في قسم البيولوجيا الجزيئية والخلوية بجامعة هارفارد. سنعرض لكم اليوم الاستجابة الحركية البصرية في أسماك zebrafish تجاه الزيادات والنقصان في شدة الضوء.

لنبدأ الآن. لبدء مقايسة الاستجابة الحركية البصرية، قم أولاً بتربية يرقات سمك الزيبرفيش من النوع البري (wild type) تحت دورة ضوئية مظلمة عند درجة حرارة 28 °C حتى تصل على الأقل إلى اليوم الرابع بعد الإخصاب. وتكون دورة الضوء والظلام المعتادة لدينا 14 ساعة من الإضاءة تبدأ في الساعة 9:00 صباحاً و10 ساعات من الظلام تبدأ في الساعة 11:00 مساءً للحصول على أفضل النتائج السلوكية.

تجنب تكدس اليرقات. عادةً ما نحتفظ بما لا يزيد عن 50 يرقة في طبق بيتري واحد. بعد خمسة أيام من الإخصاب، ننقل أسماك zebra fish إلى لوح يحتوي على 96 بئراً بحجم بئر 650 microliter من أجل توفير مساحة سباحة واسعة لليرقات.

باستخدام ماصة نقل بلاستيكية، انقل بدقة يرقة واحدة إلى كل بئر. بعد نقل الأسماك إلى الآبار، املأ كل بئر بكمية كافية من مياه الأسماك بحيث يكون سطح الماء شبه محاذٍ لحافة الآبار العلوية. توخَّ الحذر من ملء الآبار بشكل زائد أو ناقص لتجنب حدوث مشاكل بصرية في الكاميرا المستخدمة للتسجيل.

احرص أيضاً على عدم إدخال فقاعات هواء في الآبار. أصبحت الأسماك الآن جاهزة لمراقبة استجاباتها الحركية للضوء والظلام. لنقل أسماك الزيبرا الموزعة في الأطباق إلى جهاز التسجيل.

لننتقل الآن إلى معاينة جهاز التسجيل. سيتم وضع الطبق ذو الـ 96 بئراً والذي يحتوي على الأسماك داخل غرفة التسجيل هنا في هذه الصينية البيضاء، ويُثبت في مكانه باستخدام زنبرك أو شريط مطاطي. تقع الكاميرا في الجزء الخلفي من الصندوق هنا، وهي موجهة نحو الطبق باستخدام مرايا مثبتة في الجزء العلوي من الصندوق الموجود هنا.

يمكن ضبط زاوية هذه المرايا عن طريق تدوير البراغي التي تثبت المرايا في مكانها. وتتم إضاءة غرفة التسجيل من الأسفل بواسطة صمامات ثنائية باعثة للضوء (LEDs) تعمل بالأشعة تحت الحمراء، مما يسمح للكاميرا بتسجيل الأسماك حتى في الظلام.

لا تستطيع اليرقات اكتشاف الأشعة تحت الحمراء (IR)، لذا فإن هذا الإشعاع المستمر بالأشعة تحت الحمراء لا يؤثر على التجربة. كما تضيء مصابيح LED بيضاء غرفة التسجيل من الأسفل، ويتم التحكم فيها بشكل منفصل عن أضواء IR في التجارب التي تستمر لأكثر من بضع ساعات.

يمكن ملء الحجرة بمياه جارية بهدوء للمساعدة في الحفاظ على درجة حرارة ثابتة طوال مدة التجربة. يتم ضخ المياه من خزان بواسطة مضخة حوض أسماك صغيرة ويتم تسخينها إلى 28 درجة باستخدام سخان حوض أسماك غاطس نموذجي. تتصرف المياه عبر فتحة تصريف كبيرة وتعاد تدويرها إلى الخزان لتقليل الاهتزازات العشوائية الناتجة عن الغرفة.

تستقر وحدة التسجيل بأكملها فوق طاولة موازنة ثقيلة. وعندما يصبح جهاز التسجيل جاهزاً، يُستخدم غطاء صندوق لتغطية الحيوانات وعزلها بشكل أكبر عن الضوء. والآن، لننتقل إلى عملية محاذاة الـ 96.

ضع طبق الآبار مع شبكة الكمبيوتر الخاصة ببرنامج تتبع الفيديو في هذا الموضع أولاً، وهو طبق الآبار ذو الـ 96 بئرًا الذي يحتوي على الأسماك داخل غرفة التسجيل. عند استخدام حمام مائي للتجارب طويلة المدى، ضع الطبق ببطء في الماء، مع إعطاء مستوى الماء فرصة للتكيف دون أن ينسكب على الطبق. في برنامج Viewpoint لتتبع الفيديو، تأكد من أن جميع اليرقات والتجربة مرئية على شاشة الكمبيوتر.

باستخدام عناصر التحكم في البرنامج، قم بمحاذاة شبكة برنامج تتبع الفيديو مع آبار صفيحة الـ 96 بئر بحيث تكون كل سمكة داخل مربع من مربعات الشبكة. هذه الخطوة مهمة جداً لجميع تسجيلاتك، حيث سيقوم كمبيوتر التتبع بحساب الحركة بشكل منفصل لكل مربع من هذه المربعات.

لذلك، إذا لم يتم ضبط محاذاة شبكة الكمبيوتر بدقة، فقد تُفقد بعض حركات الأسماك أو قد يحدث ما هو أسوأ؛ حيث ستشغل سمكتان متجاورتان نفس المنطقة ويتم حسابهما كسمكة واحدة بعد عملية المحاذاة. وقد تم برمجة توقيت تشغيل وإطفاء الأضواء في الكمبيوتر.

عادةً ما نترك اليرقات لمدة ثلاث ساعات من التكيف مع الظلام الخفيف داخل الصندوق. ولا يهدف هذا الإجراء إلى الحصول على مستوى النشاط القاعدي فحسب، بل يمنح اليرقات أيضاً فرصة للهدوء بعد عمليات النقل والتعامل باستخدام الماصة. بعد ذلك، نغلق باب غرفة التسجيل ونبدأ في عملية التسجيل.

في الممارسة العملية، نقوم بتسجيل نشاط كل سمكة لكل ثانية، ولكن برنامج ViewPoint يسجل في الواقع البيانات إطاراً بإطار. يمكنك رؤية تتبع في الوقت الفعلي لسمكة واحدة على الشاشة أدناه. وفيما يتعلق بحركة البكسل، يشير الخط الأبيض إلى أن عدد تغيرات البكسل أقل من عتبة محددة، بينما يشير اللون الأخضر إلى أن تغير البكسل يتجاوز إعداد العتبة.

ستعتمد قيمة العتبة إلى حد ما على إعدادات الكاميرا والإضاءة الخاصة بك. بالنسبة لإعداداتنا، نستخدم عادةً عتبة قدرها أربعة بكسلات. أي أنه إذا تغير أقل من أربعة بكسلات، فإن ذلك يُعتبر خلفية.

إذا تحرك أكثر من أربعة بكسلات، فإن ذلك يشير إلى أن السمكة تتحرك. وقد حددنا تجريبياً أن هذا الحد الفاصل يكشف عن جميع حركات السباحة والدوران لدى اليرقات تقريباً. وعلى الرغم من أن صناديق التسجيل تعزل اليرقات بشكل جيد إلى حد ما، فإننا لا نزال نطفئ أنوار الغرفة ونحرص على تقليل المقاطعات الناتجة عن الضوضاء الميكانيكية، مثل إغلاق وفتح أبواب الغرفة، أو إقامة حفلة رقص أو أداء تماريننا الرياضية.

بعد الانتهاء من التجربة، انقل البيانات التي تم جمعها إلى ورقة Excel أو إلى مجموعة برامج التحليل المفضلة لديك. وهذا هو شكل البيانات؛ حيث تشتمل على الوقت والثواني منذ بدء التجربة ونشاط كل يرقة لكل ثانية.

يوضح هذا الرسم البياني نشاط يرقة واحدة طوال مدة التجربة، مع الإشارة إلى استجابات التشغيل والإيقاف المتعددة بواسطة الأسهم الموضحة على الرسم. كما يوضح هذا الرسم البياني متوسط نشاط 40 سمكة طوال مدة التجربة، مع عدة استجابات تشغيل وإيقاف كما تشير الأسهم. وكما يتضح، فإن استجابات التشغيل والإيقاف بارزة ومتسقة.

يمكن أيضاً إجراء تجربة الاستجابة الحركية البصرية هذه على الأسماك الطافرة. وفي هذه الدراسات، نقوم عادةً بوضع الأسماك من النوع البري والأسماك الطافرة في نفس الطبق وفق تخطيط رقعة الشطرنج لأغراض التحكم الأمثل. وعند استخدام الأسماك الطافرة في نفس الطبق مع الأسماك من النوع البري، تأكد من تدوين نوع السمكة التي تم وضعها في كل بئر.

إليك اقتراح حول كيفية تتبع الأسماك الموزعة في كل بئر. وفيما يلي نتائج الاستجابة الحركية البصرية، والتي تقارن بين اليرقات من النوع البري واليرقات الطافرة. ومرة أخرى، نلاحظ استجابات تشغيل وإيقاف بارزة ومتسقة من اليرقات من النوع البري.

ومع ذلك، فإن يرقات طفرة chalk، التي تفتقر إلى تطور العين، لا تزيد نشاطها بشكل ملحوظ استجابةً لزيادات أو نقص في الضوء، كما أنها تظهر مستوى أساسياً منخفضاً من النشاط. تقارن هذه النتائج استجابات النوع البري مع طفرات NO OKR، والتي تسمى أيضاً طفرات NRC. وقد ساد الاعتقاد بأن طفرة NRC عمياء تماماً بناءً على اختبار OKR.

باستخدام اختبار VMR، نوضح أن طفرة NRC تمتلك استجابة إيقاف طبيعية، بينما تكون استجابة التشغيل متأخرة وبطيئة. وبناءً على ذلك، فإن طفرة NRC ليست عمياء تماماً كما كان يُعتقد سابقاً. لقد عرضنا لكم للتو الاستجابة الحركية البصرية لأسماك zebrafish labate تجاه زيادات ونقصان الإضاءة.

عند تنفيذ هذا الإجراء، من المهم تذكر إجراء التجربة خلال النهار لأن الأسماك تكون أكثر نشاطاً واستجابة لتغيرات شدة الضوء خلال النهار مقارنة بالليل. هذا كل شيء.

شكراً لكم على المشاهدة، ومع تمنياتنا لكم بالتوفيق في تجاربكم.