ميثليته الحمض النووي مناعي

يوضح هذا الفيديو بروتوكولا لترسيب مناعي الحمض النووي الميثيل أو اللقاء. طريقة تستخدم لعزل الحمض النووي الميثيلي على وجه التحديد بطريقة غير متحيزة. تتميز مثيلة الحمض النووي في الثدييات بإضافة مجموعة ميثيل إلى الموضع C الخمسة للسيتوزين.

عند وجودها في ثنائي النوكليوتيد CPG ، فهي علامة جينية قابلة للانعكاس تلعب دورا مهما في التطور الطبيعي ، بالإضافة إلى العديد من عمليات المرض. تشمل الوظائف الطبيعية لمثيلة الحمض النووي تعطيل كروموسوم X في الإناث ، وإسكات العناصر المتكررة ، والبصمة الجينومية ، والحفاظ على الاستقرار الجيني. كما ثبت أن مثيلة الحمض النووي تلعب دورا في العديد من الأمراض مثل السرطان ومتلازمة دير ويلي ومتلازمة إنجلمان ونقص المناعة وعدم استقرار سنتري ميريك ومتلازمة شذوذ الوجه.

في السرطانات ، على سبيل المثال ، يمكن أن يؤدي فرط الميثيل غير الطبيعي والمحفزات إلى إسكات الجينات الحيوية الكابتة للورم. في حين أن نقص الميثيل غير السليم يؤدي إلى عدم استقرار الكروموسومات وتنشيط الجينات المسرطنة ، يتم تحقيق لقاء من خلال أول الحمض النووي للتزلج الصوتي إلى أجزاء يتراوح حجمها من 300 إلى 1000 زوج أساسي. ثم يتم تغيير طبيعة الحمض النووي الصوتي عند 95 درجة مئوية.

تضاف الأجسام المضادة الأولية ، التي تتعرف على خمسة ميثازين رئيسي ، وتسمح لها بربط شظايا الحمض النووي الميثيلي. تستخدم الأجسام المضادة الثانوية ، المترافقة مع حبيبات الدينا المغناطيسية لعزل شظايا الحمض النووي ، والتي تم ربطها بالجسم المضاد الأساسي. تتم إزالة الأجزاء غير الميثيلية ويتم هضم الأجسام المضادة بواسطة البروتيناز.

يزيل تنظيف كلوروفورم فينيل KA البروتين المهضوم وينشط الترسيب الحمض النووي ، الذي يتم إثرائه الآن للشظايا الميثيلية. Meetup ، يمكن استخدام الحمض النووي لتطبيقات مثل المصفوفة الدقيقة PCR والتسلسل. يتم إجراء Meetup بشكل عام كإجراء لمدة يومين.

يتضمن اليوم الأول إعداد الحمض النووي ، والصوتنة ، والترسيب المناعي ، وهضم البروتين. يتضمن اليوم الثاني استخراج الأس الهيدروجيني والكلوروفورم وهطول الإيثانول لتنقية وعزل الحمض النووي المخصب للمثيلة. هناك عدد قليل من المواد الخاصة المطلوبة للاجتماع ، بما في ذلك أنابيب الطرد المركزي المصنوعة من السيليكون ، وجهاز شمس الحمض النووي ، والجسم المضاد الأساسي ، وفأر الميثازين المضاد لخمسة رئيسيات ، والجسم المضاد أحادي النسيلة ، والجسم المضاد الثانوي ، وخرز الدينا ، المترافق مع الأغنام ، و IgG المضاد للولايات المتحدة ، ورف الأنبوب المغناطيسي.

الخطوة الأولى في بروتوكول اللقاء هي إعداد الحمض النووي. من الضروري تقييم طبيعة الحمض النووي مسبقا. مطلوب معرفة حالة عينة الحمض النووي ، سواء كانت مزدوجة أو مفردة تقطعت بهم السبل بشكل أساسي لأن الكمية الدقيقة للعينة لها أهمية قصوى ويمكن أن تتأثر الطرق المختلفة لتحديد كمية الحمض النووي سلبا بوجود أنواع الحمض النووي غير المرغوب فيها.

يمكن تقييم كمية الحمض النووي المزدوجة التي تقطعت بهم السبل بسهولة عن طريق القياس الضوئي الطيفي باستخدام NanoDrop 3 ، 300 nd load 1.5 ميكرولتر وتعيين نوع القياس على الحمض النووي ، وحدد DNA 50 كحساب وتهيئة الأداة ب 1.5 ميكرولتر من الماء. نظف الركائز وأفرغ الأداة ب 1.5 ميكرولتر من السائل. يتم إذابة العينة في تنظيف الركائز ، وتحميل 1.5 ميكرولتر من العينة وضرب القياس.

سيتم إعطاء التركيز ويمكن استخدامه. لحساب عدد الميكرولتر المطلوب بالنسبة لي ، فإن انخفاض نسبة A اثنين 60 إلى 80 من 1.8 مثالية هنا. يتم تحضير عينة ميكروغرام واحد.

ومع ذلك ، فإن عينة أقل من 200 نانوجرام كافية للحصول على نتائج ناجحة. للاجتماع ، قم بتحميل عينة الحمض النووي في أنبوب نظيف من السيليكون. أضف كمية كافية من الماء المعقم ليصل الحجم النهائي إلى 50 ميكرولترا.

يجب إجراء صوتنة الحمض النووي والترسيب المناعي في أنابيب السيليكون لمنع الارتباط غير المحدد للحمض النووي والبروتينات بجدران الأنبوب. بمجرد إعداد الحمض النووي ، يجب أن تكون العينة صوتية مطلوبة لتجزئة الحمض النووي لأن الترسيب المناعي أكثر كفاءة مع أجزاء أصغر من الحمض النووي ، وتحميل العينة في الصوتنة ، والتأكد من ضبط إعداد الطاقة على ارتفاع ، وأن الجهاز مضبوطات على 30 ثانية. في 30 ثانية ، املأ القاعدة في خط التعبئة بأربع درجات مئوية من الماء.

صوتنة العينة لمدة سبع دقائق. عند الانتهاء من الصوتنة ، قم بإزالة الأنبوب وضعه على الجليد. من المهم تحسين ظروف صوتنة العينة المتوقعة ، حجم الحمض النووي مسبقا.

على سبيل المثال ، ستتطلب عينة الحمض النووي المتدهورة جزئيا وقتا أقصر للصوتنة. يمكن تصور منتجات صوتنة من خلال تقنيات الكهربية القياسية. شظايا الحمض النووي التي يتراوح حجمها من 300 إلى 1000 زوج أساسي مطلوبة في هذه المرحلة لاستخدامها لاحقا.

في فحوصات المصفوفات الدقيقة و PCR ، يجب عليك الاحتفاظ بخمس الحمض النووي الخاص بك ليكون بمثابة مدخلات أو مرجع في هذه الحالة ، سيتم استخدام 800 نانوجرام من الحمض النووي الموفوق للصوت للترسيب المناعي وسيتم تخصيص الباقي كمرجع للحمض النووي. الخطوة التالية في بروتوكول الوسائط هي الترسيب المناعي أو تفاعل IP قبل إضافة الجسم المضاد الأساسي ، يجب تغيير طبيعة الحمض النووي. التمسخ مطلوب لأن الجسم المضاد الأساسي حساس للحمض النووي الفردي الذي تقطعت به السبل.

ضع العينة في حمام مائي على حرارة 95 درجة مئوية لمدة 10 دقائق. عند اكتمال خطوة التمسخ ، انقل الأنبوب على الفور إلى الجليد لمدة خمس دقائق على الأقل. سيمنع ذلك تشويه الحمض النووي من ركوع رين وسيسمح بربط الأجسام المضادة الأمثل عندما تبرد العينة.

قم بتدوير الأنبوب لفترة وجيزة لسحب المحتويات إلى الأسفل. بعد ذلك ، يجب إضافة الجسم المضاد الأساسي. يجب معايرة كمية الجسم المضاد المستخدمة لكل دفعة ولكل مصنع.

في هذه الحالة ، نضيف خمسة ميكروغرامات من الجسم المضاد الأولي ثم نضيف المخزن المؤقت للترسيب المناعي أو المخزن المؤقت IP إلى الحجم النهائي البالغ 500 ميكرولتر. بعد ذلك ، يتم وضع الحمض النووي IP في دوار ويترك للاحتضان عند أربع درجات مئوية لمدة ساعتين. الدوران مطلوب لمنع تكتل الأجسام المضادة داخل الأنبوب أثناء الحضانة.

قبل حوالي 15 دقيقة من اكتمال حضانة الأجسام المضادة الأولية ، قم بتنظيف وإعداد حبات الدينا المغناطيسية. أولا ، قم بإعادة تعليق الخرز تماما في القارورة عن طريق الدوامة. ثم انقل 30 ميكرولترا من الخرز إلى أنبوب نظيف من السيليكون وضع هذا الأنبوب على رف مغناطيسي لتفاعلات متعددة.

انقل 30 ميكرولترا من الخرز لكل تفاعل ، بالإضافة إلى ما يكفي لتفاعل إضافي واحد للسماح بخطأ في سحب العينة أو الفقدان غير المقصود لبعض الخرز. على سبيل المثال ، لثمانية تفاعلات. قم بإزالة ما يكفي من الخرز لتسعة تفاعلات أو 270 ميكرولتر.

سيتم سحب الخرزات المغناطيسية نحو جدار الرف المغناطيسي. اترك دقيقتين حتى تهاجر الخرزات وتستقر في خط محدد على جدار الأنبوب. بعد ذلك ، قم بإزالة الماصة الطافية والتخلص منها بعناية مع التأكد من تجنب إزعاج الخرزات الموجودة على الجدار الخلفي بطرف الماصة.

استبدل المادة الطافية بحجم زائد من دوامة المخزن المؤقت IP وضعها مرة أخرى على الرف المغناطيسي لمدة دقيقتين. كرر هذا الغسيل مرة أخرى وأعد تعليق حبات الغسيل في حجمها الأصلي من المخزن المؤقت IP. استرجع أنبوب العينة من الدوار عند الانتهاء من الحضانة.

لإكمال الترسيب المناعي ، أضف 30 ميكرولترا من الخرز النظيف إلى التفاعل وضع الأنبوب مرة أخرى في دوار لمدة ساعتين عند أربع درجات مئوية. خلال هذه الحضانة ، سوف يرتبط الجسم المضاد الثانوي ، وهو IgG المضاد للفأر ، بالجسم المضاد للفأر الأساسي. يتم اقتران الأجسام المضادة للفأر مع حبات الدينا المغناطيسية ، مما يسمح باستعادة المنتجات المرتبطة بسهولة وخطوة التنقية التي يجب اتباعها.

بمجرد اكتمال الحضانة بكلا الأجسام المضادة ، ضع أنبوب IP على الرف المغناطيسي لمدة دقيقتين. في هذه المرحلة ، سيكون الحمض النووي الميثيلي مرتبطا بالجسم المضاد الأساسي ، والذي سيكون مرتبطا بالجسم المضاد الثانوي المترافق مع حبة الدينا. قم بإزالة المادة الطافية والتخلص منها واستبدلها ب 500 ميكرولتر من المخزن المؤقت IP.

امزج محتويات الأنبوب وضعه مرة أخرى على الرف لمدة دقيقتين. كرر هذا الغسيل باستخدام مخزن IP المؤقت مرة أخرى. بعد إزالة المادة الطافية من آخر غسل Resus ، قم بتعليق الخرز للمرة الأخيرة.

في 400 ميكرولتر من محلول الهضم ، عالج التفاعل ب 100 ميكروغرام من بروتيناز K واحتضانه طوال الليل عند 50 درجة مئوية. يعد علاج البروتيناز K ضروريا لهضم بروتينات الأجسام المضادة وأي بروتين متبقي مرتبط بالحمض النووي ، مما يسمح بإطلاق الحمض النووي الميثيلي في المحلول. يتم تنقية الحمض النووي في اليوم الثاني من إجراء اللقاء ، واسترجع أنبوب الهضم من الحاضنة.

في غطاء الدخان ، أضف 500 ميكرولتر من كلوروفورم الفينو واحد لواحد عند درجة الحموضة سبعة إلى الأنبوب وقم بتدوير الأنبوب جيدا لمدة 10 دقائق عند 13 ، 000. ز- قم بإزالة الطور المائي العلوي بعناية من الأنبوب دون إزعاج الواجهة أو إزالة أي من الطبقة العضوية. نقل المرحلة المائية إلى أنبوب جديد.

يمكن إجراء استخراج ثان إذا ظهرت الواجهة غائمة. بعد ذلك، أضف حجما واحدا 10 من ثلاثة أسيتات صوديوم مولية في هذه الحالة، 40 ميكرولترا. يمكن استخدام ميكرولتر واحد من الجليكوجين كناقل لتسهيل تنظيف الحبيبات.

دوامة الأنبوب لخلط المحتويات. ثم أضف مجلدين من الإيثانول بنسبة 100٪ ، دوامة وقم بتجميدها في فريزر 20 درجة مئوية تحت الصفر لمدة 20 دقيقة بعد التجميد. يتم تدوير الحمض النووي المترسب في جهاز طرد مركزي عند 13،000 جم وأربع درجات مئوية لمدة 20 دقيقة.

سوف تتشكل حبيبات الحمض النووي في الجزء السفلي من الأنبوب. استرجع الأنبوب من جهاز الطرد المركزي وقم بإزالة الإيثانول. احرص على عدم إزعاج الحبيبات الموجودة في قاع الأنبوب.

قد يكون الدوران النبضي ضروريا لإزالة أي إيثانول متبقي. لغسل الحبيبات ، أضف 500 ميكرولتر من البرد ، 70٪ دوامة الإيثانول ، ثم قم بالدوران مرة أخرى لمدة 20 دقيقة عند 13 ، 000 جم وأربع درجات مئوية. عند اكتمال الدوران الثاني ، قم بإزالة دوران نبضة الإيثانول بنسبة 70٪ وإزالة الإيثانول المتبقي باستخدام ماصة.

اترك الأنبوب على رف مع فتح الغطاء لتجفيف الحبيبات والسماح للإيثانول المتبقي بالتبخر. أخيرا ، يقوم Reus بتعليق الحبيبات التي تحتوي فقط على الحمض النووي المخصب للمثيلة و 10 ميكرولتر من الماء المعقم ، مما يتيح وقتا كافيا لتذوب حبيبات الحمض النووي قبل الاستخدام. من الممارسات الجيدة التحقق من كفاءة اللقاء عن طريق تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR).

يمكن القيام بذلك عن طريق تشغيل تفاعلات تفاعل البوليميراز المتسلسل المصممة لتضخيم المنتجات التي توضح شظايا الحمض النووي الميثيلية وغير الميثولة بشكل تفاضلي لتضخيم بادئات الحمض النووي البشري العادية. يمكن استخدام منطقة التحكم في البصمة H 19 جنبا إلى جنب مع البادئات المصممة لتضخيم منطقة من الجينوم ، والتي لا يتم ميثيليتها. على سبيل المثال ، يمكن العثور على التسلسلات التمهيدية وظروف دورة تفاعل البوليميراز المتسلسل في البروتوكول المصاحب.

في هذه المرحلة ، من الضروري استرداد المدخلات أو الحمض النووي المرجعي الذي تم وضعه جانبا في بداية بروتوكول اللقاء. سيتم إعداد مجموعة واحدة من تفاعلات تفاعل البوليميراز المتسلسل باستخدام الحمض النووي المدخل ، وستستخدم المجموعة الأخرى الحمض النووي IP المخصب للمثيلة. إذا كان الاجتماع ناجحا ، فسينتج IP-PCR منتجا باستخدام بادئات المثيلة ولا يوجد منتج يستخدم بادئات التحكم.

على العكس من ذلك ، يجب أن ينتج مدخل تفاعل البوليميراز المتسلسل منتجات باستخدام كلا البادئات لأنه يحتوي على كل من الميثيل وغير الميثيلي. شظايا الحمض النووي. يمكن استخدام الحمض النووي المخصب للشظايا الميثيلية في عدد من التطبيقات النهائية ، مثل تسلسل تفاعل البوليميراز المتسلسل وتحليل المصفوفات الدقيقة.

عند دمجها مع تقنيات البيولوجيا الجزيئية الأخرى ، يمكن استخدامها للتحقيق في حالة مثيلة الحمض النووي بطريقة محددة أو على نطاق الجينوم لتشكيل المثيلة أو دراسة علم الجينوم.